桑仙降压颗粒对自发性高血压大鼠心肌MVD和ESM1蛋白表达的干预*

张蕴慧

（山东省中医药大学国家高血压中医临床研究基地国中局中医心病学重点专科，山东济南250014）

高血压的研究机理颇多，鲜有与微血管相关联，然而微血管数目、质量降低导致的缺血性脑卒中、冠心病又严重影响着高血压的预后，因此，高血压微血管研究可能对预防心、脑、肾等靶器官损害起到积极作用。本研究将MVD及ESM1引入到高血压研究中，通过微血管数目及血管生成因子的影响，来探讨中药预防高血压及靶器官损害的机制，为临床应用提供可引证的依据。

1 材料与方法

1.1 动物4周龄自发性高血压大鼠，雌雄各半，体质量200～240 g，由中国医科院阜外心血管医院提供，医动字第01-108号。4周龄Wistar大鼠，雌雄各半，体质量210～250 g，由山东医科大学动物室提供，动物合格证号：SCXK（鲁）20090001。

1.2 药物桑仙降压颗粒，组方：桑寄生、淫羊藿、丹参、川芎等，由山东中医药大学中药制剂室按正交试验法优选工艺制成，每克含生药6 g，临用前加蒸馏水稀释成含生药0.8 g/mL的药液。吲哒帕胺片2.5 mg/粒，由天津力生制药股份有限公司提供，实验前加0.9%氯化钠注射液适量，制备成浓度0.025 mg/mL的混悬液，置4℃冰箱保存备用，使用前振荡，充分摇匀。

1.3 试剂生物素化山羊抗兔CD34抗体、生物素化山羊抗兔IgG，链霉亲和素2生物素（SABC）和DAB显色剂，均由武汉博士德生物工程有限公司提供；Anti-ESM1，为美国santacruz公司产品。

1.4 仪器METTLERAE20型电子分析天平，海特勒托利多（上海）仪器有限公司提供；康乐电热恒温水浴槽，上海医疗器件七厂提供；光学显微镜，由山东省中医院病理科提供。

1.5分组与给药以A标示正常对照组即wistar大鼠组；B、C、D分别标示自发性高血压大鼠不同的给药方式。B：自发性高血压大鼠给予蒸馏水为空白对照组。C：自发性高血压大鼠给予吲哒帕胺为西药对照组。D：自发性高血压大鼠给予桑仙降压颗粒为试验组。观测时相点：0组的观测时间为wistar大鼠、自发性高血压大鼠4周龄。1、2的观测时间为wistar大鼠、自发性高血压大鼠给药后4周、8周。在3个观测时间点分别观测，分组为A0、B0；A1、B1、C1、D1；A2、B2、C2、D2，随机分组方法 ，每组6只。

1.6 标本采集用戊巴比妥钠（40mg/kg体质量）腹腔注射麻醉后，立即经腹主动脉注入4℃0.9%氯化钠注射液，切开下腔静脉放血，待冲洗液干净无色后，立即开胸，快速分离、摘取心脏，置入4℃0.9%氯化钠注射液中快速冲洗3次，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规切片。

1.7 CD34标记MVD采用免疫组化SP法。结果 判断：参照AXIOTIS等［2］的标准，由两位病理医生采用盲法（独立检测）在高倍镜（×400）下读片。每张切片高倍镜下随机选取10个不重复的视野（不足10个视野的，按实际观察到的视野计数），共纪录1000个细胞，综合染色强度和阳性细胞数量进行判定。（1）按切片中细胞着色深浅评分：0分为细胞无显色；1分为黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。（2）按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：1分为＜25%；2分为≥25%且≤50%；3分为＞50%且≤75%；4分为＞75%。取（1）、（2）两项评分的乘积作为总积分：0～3分为（-）；＞3分且≤6分为（+）；＞6分且≤9分为（++）；＞9分（+++）。（-/+）为低表达，（++/+++）为高表达。

1.8 ESM1蛋白含量检测由两位病理医生采用盲法（独立检测）在高倍镜（×400）下读片。每张切片高倍镜下随机选取10个不重复的视野（不足10个视野的，按实际观察到的视野计数），共纪录1000个细胞，综合染色强度和阳性细胞数量进行判定。结果 判定同CD34。

1.9 统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组CD34表达比较见表1、图1。实验前，与正常对照组相比，空白对照组心肌CD34表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验4周，自发性高血压大鼠各组CD34表达减少，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组比较，试验组、西药对照组CD34表达均有增多趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；实验8周，与空白对照组比较，试验组与西药对照组CD34表达均明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01），两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 ESM1蛋白含量检测结果 比较见表2，图2。实验前，空白对照组大鼠ESM1蛋白光密度值与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。实验4周，空白对照组大鼠ESM1蛋白光密度值降低，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。与空白对照组比较，西药对照组与试验组ESM1蛋白光密度值均有升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验8周，空白对照组大鼠ESM1蛋白光密度值明显降低，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。与空白对照组比较，西药对照组与试验组ESM1蛋白光密度值均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。两组间相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组CD34表达积分比较（±s）

表1 各组CD34表达积分比较（±s）

与同观测点正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与同观测点空白对照组比较，△P＜0.01。下同。

实验前实验4周后9.56±0.689.43±0.71空白对照组实验8周后正常对照组9.49±0.54组别n66 7.28±0.47*7.08±0.31*西药对照组67.20±0.35*6.67±0.49*△试验组67.15±0.40*6.43±0.77*△3.32±0.64**

图1 各组CD34表达免疫组化染色（×400）

表2 各组大鼠ESM1蛋白光密度值表达积分比较（±s）

表2 各组大鼠ESM1蛋白光密度值表达积分比较（±s）

实验前实验4周后7.50±0.497.88±0.89空白对照组实验8周后正常对照组8.03±0.45组别n66 7.04±0.56*5.78±1.45**西药对照组66.02±1.717.54±0.98△试验组66.43±0.697.79±1.21△△4.56±0.79**

图2 各组ESM1蛋白表达免疫组化染色（×400）

3 讨论

在本实验中发现自发性高血压大鼠在4周龄时，出现微血管数目明显减少，并随病程增加出现递减趋势，且高血压伴其他危险因素、靶器官损害或临床疾病，在降压的同时，需要治疗所有可逆性危险因素、靶器官损害以及各种并存的临床疾病［2］。因此，在降压的同时能够保护微血管损害应成为防止高血压引发心肌损害的重要措施之一。

微血管计数可根据血管内皮标记物来判定，在血管内皮标记物如Ⅷ因子相关抗原如CD31和CD34抗原中，以CD34抗原特异性最高，CD34被认为是最敏感的血管内皮标记物，因此CD34免疫组化染色可测量组织微血管密度和面积［5］，作为评价微血管密度的指标之一。实验结果 显示：实验前，与正常对照组相比，空白对照组心肌CD34表达明显减少；实验4周、8周后与正常对照组相比，随周龄增加空白对照组CD34蛋白表达逐渐增加，使用桑仙降压颗粒剂、吲哒帕胺干预后，CD34蛋白含量较空白对照组明显减少，表明4周龄SHR已存在微血管密度减少。在研究中笔者发现，桑仙降压颗粒组在实验4周时对微血管有保护趋势，桑仙降压颗粒、吲哒帕胺用药8周可减轻SHR的微血管损害，但二者作用无统计学差异。

对微血管的保护依赖于血管生成因子，实验所选择的另一个指标是ESM1。血管内皮细胞在静止状态下，仅有短暂的、严密调控的血管生成，在正常成人组织，一些抑制血管生成的因子占优势，在缺氧、药物等因素的刺激下，促进血管生成的因子如VEGF等可大量释放，使内皮细胞活化，形成新的血管，而ESM1因子正是与VEGF呈正相关的因子，因此本实验选择ESM1作为微血管生成的促进因子进行观测。结果 显示，实验前空白对照组ESM1蛋白光密度值降低；而实验4周、8周后ESM1蛋白光密度值的含量呈逐渐减少趋势，使用桑仙降压颗研究粒剂、吲哒帕胺干预后，ESM1蛋白光密度值的含量较空白对照组明显增多，说明4周龄自发性高血压大鼠心肌已有ESM1减少，桑仙降压颗粒、吲哒帕胺用药4周、8周均可促进ESM1的表达。

本实验结果 提示，桑仙降压颗粒剂具有保护微血管作用，其机理可能与增强ESM1蛋白密度值的表达有关。降压疗效确切的桑仙降压颗粒［6］可很好地保护微血管，是否还可通过影响其他血管生成或抑制因子进而减轻靶器微血管损害，尚待进一步研究。

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［6］ 张蕴慧.桑仙降压颗粒对自发性高血压大鼠平滑肌细胞Ki-67、bFGF的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2004，2（5）：274-275.