氢气预处理对乳鼠海马神经元细胞缺氧／复氧损伤后细胞活力的影响

卢 欣

郑州大学基础医学院 郑州 450052

由于缺血再灌注或炎症引起的氧自由基损伤是导致众多疾病的原因之一。氢气作为抗氧化剂可以选择性地减少细胞内氧自由基，从而起到预防和治疗疾病的作用。氢气可以选择性减少羟自由基，特别是活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），从而保护细胞。但氢气并不直接与ROS反应，通入氢气可以减轻和抑制氧应激造成的损伤程度。由于氢气可以快速通过细胞膜，因此可作为高效的抗氧化剂，减少细胞内ROS的生成来减少氧损伤从而保护细胞［1］。本实验用MTT法检测氢气预处理后的海马神经元细胞活力，观察氢气对神经元细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级新生SD乳鼠（＜24h），由郑州大学实验动物中心提供，DMEM高糖培养基（美国Sigma公司），特级胎牛血清（美国Sigma公司），胰蛋白酶粉（美国Sigma公司），NSE染色试剂盒（美国Sigma公司），MTT试剂（美国Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 体外培养海马神经元细胞：实验步骤：用75%酒精消毒新生SD乳鼠（＜24h）8只，在超净工作台内断头取出颅脑，放入预冷的PBS缓冲液中，剥离两侧海马，在体视显微镜下剔除被膜和血管，剪成0.5mm3大小的组织块，加入0.25%胰蛋白酶10mL，37℃水浴消化15min，每间隔5min吹打混匀1次。加入等体积含10%FBS的DMEM培养液终止消化3min，加入3倍体积培养基吹打混匀，用2 000目尼龙网过滤细胞悬液。调整细胞密度，按2×105／mL接种于6孔培养板和9×104／mL接种于96孔培养板中，置入37℃、5%CO2培养箱中培养，隔日换液，取第5天细胞进行实验。1.2.2 实验分组：随机分为3组，对照组：常规培养；缺氧／复氧组（H／R组）：细胞在100%N2中培养15min后放入37℃、5%CO2培养箱中培养30min，造成缺氧／复氧损伤；氢气预处理组：细胞在2%H2＋98%N2中培养15min后放入37℃、5%CO2培养箱中培养30min。

1.2.3 神经元鉴定：将处理后6孔板中细胞用1：1的甲醇：丙酮固定30min，用预冷的PBS冲洗3遍后，按照进行NSE试剂盒说明书进行免疫化学染色，着色阳性为棕黄色。

1.2.4 细胞活力测定：将处理后96孔细胞培养板每孔加入MTT（5g／L）20μL和180μL无血清培养液，孵育4h后终止培养。尽可能吸净每孔MTT液后，加入100μL二甲基亚砜（DMSO），震荡10min，在酶联仪595nm处测定吸光值（OD）。细胞活力（%）＝（实验组OD／对照组OD）×100%。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫化学染色显示：对照组视野布满棕黄色阳性细胞，细胞胞体不规则，神经突触互相连接成网；缺氧／复氧组棕黄色阳性细胞数较少，细胞皱缩，神经突触很少，氢气预处理组棕黄色阳性细胞数比缺氧／复氧组多，仍能看到不规则的胞体形态，仍有连接的神经突触。

细胞活力测定显示：以对照组海马神经元的细胞活力100%，缺氧／复氧组（39.8±2.41）%，氢气预处理组（51.0± 1.94）%。与对照组比较，缺氧／复氧损伤使细胞活力大为降低（P＜0.05），而氢气预处理组的细胞活力较缺氧／复氧组明显升高（P＜0.05），说明氢气能够提高海马神经元细胞的活力，减少缺氧／复氧损伤。

3 讨论

氢气是一种双原子气体，密度小于空气，在一些化学反应中有一定的还原性，被认为是惰性气体。Downey等［2］的研究表明，氢气（hydrogen，H2）可能是除了一氧化碳（carbon monoxide，CO）、硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）和一氧化氮（nitric oxide，NO）的第四类气体类的信号分子（gasotransmitter），在某些情况下可以参与机体的抗氧化过程［3］。Maier等［4－6］的研究表明，大鼠吸入2%氢气可显著减轻脑缺氧／复氧损伤，说明氢气是一种比较理想的细胞保护剂。这是由于氢气是一种较小的生物活性分子，透过细胞膜的速度较快，又易于进入线粒体。虽然氢气不直接和氧自由基反应，但可作为高效的抗氧化剂，选择性地减少ROS［7］。

本实验通过体外培养海马神经元细胞，制造缺氧／复氧损伤模型，采用免疫化学鉴定和MTT法初步探讨了氢气对海马神经元细胞缺氧／复氧损伤的保护作用。该实验结果表明氢气预处理可增加细胞活力，从而对离体的海马神经元细胞缺氧／复氧损伤起到保护作用。

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［3］ Downey JM，Cohen MV.A really radical observation－a comment on pennaet［J］.Basic Res Cardiol，2006，101：190－191.

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［5］ 孙学军，Zhang JH.氢——一种内源性抗氧化剂［J］.第二军医大学学报，2008，29（3）：233－235.

［6］ Hayashida K，Sano M，Ohsawa I，et al.Inhalation of hydrogen gas reduces infarct size in the rat model of myocardial ischemiareperfusion injury［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，37（1）：30－35.

［7］ Fukuda K，Asoh S，Ishikawa M，et al.Inhalation of hydrogen gas suppresses hepatic injury caused by ischemia／reperfusion through reducing oxidrative stress［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，36：670－674.