免疫层析法检测MPT64蛋白在结核与非结核分枝杆菌鉴定中的临床应用价值

李国利 赵 铭 张灵霞 王 倩

解放军第三〇九医院结核病研究所，北京 100091

分枝杆菌属内菌种繁多，除结核分枝杆菌复合群（mycobacterium tuberculosis complex，MTC）和麻风分枝杆菌外，其他的分枝杆菌统称为非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacterium，NTM）。近年来，世界范围内结核病与非结核分枝杆菌病发病率明显升高。在结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）临床检验时，遇到NTM的频率正在增加。NTM中遇到比例较高的主要有堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌。我国全国结核病流行病学抽样调查（流调）结果表明[1]，2000年第4次流调NTM分离株占分枝杆菌分离株的11.1%，高于1979年第 1次流调的4.3%，1984/1985年第 2次流调的4.2%和第3次流调的4.9%。特别值得注意的是我国曾发生过多起NTM爆发感染。NTM病与结核病临床表现相似，难以鉴别；NTM与MTB药物敏感性差异很大，许多NTM对抗结核药物天然耐药，其治疗方案与结核病有所不同。分枝杆菌菌种鉴定不仅在流行病学上有重要意义，而且关系到临床的正确诊断和正确治疗。

目前，在结核病临床实验室，涂片抗酸染色镜检和分枝杆菌分离培养是结核病病原学的主要检测方法，但由于方法学的限制即使是涂片或/和培养阳性,也仅说明检出了抗酸杆菌和分枝杆菌，而难以确定是MTB还是NTM。因此，需要进行分枝杆菌菌种鉴定。MTC（包括MTB、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌）和NTM菌群的初步鉴定是进一步分枝杆菌菌种鉴定的首要步骤。传统的MTC与NTM菌群鉴别需通过观察菌株的菌落形态、颜色特征，进行对硝基苯甲酸（PNB）培养基上生长试验，28℃生长试验，耐热触酶试验来完成[2]。操作步骤多，由于涉及到培养而耗时长，通常慢生长分枝杆菌需3～4周，快生长分枝杆菌需1周。因此，建立简便、快速、准确的MTC与NTM鉴别方法很有必要。本文旨在评估以免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别MTC与NTM的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 菌株

21株分枝杆菌标准菌株，其中包括4株结核分枝杆MTC标准株（MTB、牛分枝杆、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌）和17株NTM标准株（堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、次要分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、土地分枝杆菌、不产色分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌和母牛分枝杆菌），来源于中国药品生物制品检定所。135株MTB临床分离株和45株NTM临床分离株，其中堪萨斯分枝杆菌14株，鸟分枝杆菌3株，胞内分枝杆菌7株、瘰疬分枝杆菌5株、戈登分枝杆菌4株、脓肿分枝杆菌6株、偶然分枝杆菌2株，次要分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、不产色分枝杆菌和金色分株杆菌各1株，来源于本室-80℃保藏菌株。分枝杆菌培养物均经抗酸染色检测为阳性（+），并已经传统的MTC与NTM菌群鉴别试验和16S～23S rDNA间隔区测序[3]分枝杆菌菌种鉴定。

1.2 试剂

MPT64检测板来源于杭州创新生物检控技术有限公司。

1.3 检测方法

将-80℃保藏菌株传代培养，取适量改良罗氏培养基上新鲜培养物加入到含200 μL缓冲液试管中，加盖后，用漩涡混合器充分搅拌制备成菌悬液。取100 μL滴入检测板上样品孔内，室温放置15 min观察结果。试剂盒显示窗左侧条带为对照条带（C），右侧为检测条带（T），对照和检测条带均显示紫红色表示MPT64检测阳性，只有对照条带显示紫红色表示检测阴性。若对照条带未显色，表示检测结果无效，需更换试剂重新检测。

2 结果

所有分枝杆菌菌株检测均出现对照条带，均为有效结果。

2.1 分枝杆菌标准株检测结果

4株MTC标准菌株MPT64检测均为阳性，17株NTM标准菌株MPT64检测均为阴性。

2.2 分枝杆菌临床分离株检测结果

135株MTB临床分离株MPT64检测，其中134株为阳性，1株为阴性。45株NTM分离株MPT64检测均为阴性。

2.3 特异性、敏感性和准确度结果

4株MTC标准菌株和135株MTC临床分离株中，除1株临床分离株检测阴性外，其余均为阳性，检测的敏感性为99.3%（138/139）；17株NTM标准株和45株NTM临床分离株MPT64检测均为阴性，检测的特异性为100%（62/62）；对62株NTM菌株（包括标准株和临床分离株）、4株MTC标准株和135株MTB临床分离株菌群鉴定的准确度为99.5%（200/201）。

3 讨论

MTB分泌性蛋白是MTB在早、中期生长过程中释放于细胞外的一组蛋白，游离于菌体周围或培养基液中。MPT64蛋白是MTB培养早期即分泌至菌体外的一种可溶性蛋白，在MTB分泌性蛋白中所占比例最大，最早在牛分枝杆菌中发现，称为MPB64（MPB64与MPT64系同一蛋白，只是依来源不同而命名）。它由RD2区RV1908基因编码，ORF为687 bp，编码228个氨基酸，相对分子量为24 000，是MTC的特异性抗原蛋白，只存在于MTC菌株和某些BCG中，在NTM菌株中缺乏该基因[4]，因此检测它在分枝杆菌中的有无，可将MTC与NTM相鉴别[5-6]。

本文所采用的免疫层析试剂板内置由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试剂条。胶体金垫内含胶体金标记的鼠抗MPB64单克隆抗体A，硝酸纤维素膜上包被固化的鼠抗MPB64单克隆抗体B（检测线）和抗鼠免疫球蛋白多克隆抗体（对照条线）。鼠抗MPB64单克隆抗体A和B识别MPT64蛋白的不同表位。当样品从检测板样品孔滴下后，由样品垫吸收扩散至胶体金垫，胶体金标记的鼠抗MPB64单克隆抗体A被熔解，若样品中存在MPT64蛋白抗原，则与胶体金标记抗体形成免疫复合物，因毛细管层析作用而在硝酸纤维素膜上移动，被膜上固化的鼠抗MPB64单克隆抗体B捕获，在胶体金作用下在检测线形成紫红色条带。反之，若样本中无MPT64蛋白，则无条带产生。另一方面，无论样品中是否存在MPT64蛋白抗原，剩余的胶体金标记抗体A在硝酸纤维素膜上继续移动，被膜上固化的抗鼠免疫球蛋白多克隆抗体捕获，因胶体金作用而在对照线产生紫红色条带，这显示了胶体金标记抗体在硝酸纤维素膜上的正常移动。

本文采用免疫层析法检测MPT64蛋白鉴定MTB和NTM，结果表明其特异性、敏感性和准确度分别为100%、99.3%和99.5%。在4株MTC标准菌株和135株MTB临床分离菌株中，138株检测阳性，仅1株MTB临床分离株检测阴性，分析其原因可能是由于该菌株MPT64编码基因Rv1908突变或缺失所致，国内外均有报道[7-9]，与笔者所得结果一致，所占比例极低。该方法不仅特异性强，敏感性和准确度高，同时与传统的菌群鉴定方法和DNA测序的分子诊断方法比较操作简便、快速，不需特殊仪器设备，15 min即可报告结果，极易在各级分枝杆菌临床实验室普及开展，具有良好的临床应用前景。

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