β-榄香烯和NDV共修饰对脂质体瘤苗的免疫增强作用

高天慧 段芳龄 刘明月 李晓燕 戚麟

肿瘤疫苗作为手术及放疗、化疗的辅助治疗常用来改善宿主的免疫状态，调动机体的免疫反应，杀灭残留在体内的肿瘤细胞。但是由于放疗、化疗的毒副作用及癌症本身，患者的免疫系统往往处于抑制状态，同时肿瘤抗原性弱，肿瘤细胞表达的MHC-I类分子减少或缺如，不能有效地将肿瘤抗原提呈给CD+8T细胞，因此，单纯用肿瘤抗原进行免疫治疗，往往不能诱导有效的抗肿瘤免疫反应。本研究采用新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)losota株来修饰H22肝癌细胞，并将NDV修饰的H22肝癌细胞可溶性抗原(NDV-H22抗原)与免疫增强剂β-榄香烯共包于脂质体中，以期得到更进一步的抗瘤效应，为临床抗肝癌治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 BalB/c纯系小鼠，由河南省实验动物中心提供，动物合格证号为SYXK(豫)2005-0012，4-6周龄，体重16～18 g，健康，清洁级饲养，60只，雌雄各半;小鼠 H22肝癌细胞由BalB/c小鼠腹腔传代，引自河南省医学科学研究所;新城疫病毒losota株由河南农业大学牧医学院微生物教研室卢中华教授惠赠。大豆卵磷脂(PC)，上海油脂一厂;胆固醇(CH)，日本株式会社;十八烷氨(SA)，sigma;牛血清白蛋白，B1B公司;新生小牛血清，天津正江高新技术开发公司;淋巴细胞分离液，上海劲马生物科技有限公司;β-榄香烯，大连金港制药有限公司。Beckman高速低温离心机，Beckman公司;Eppendorf高速低温离心机C5417R，Eppendorf公司;CO2培养箱，美国A1SCO;旋转蒸发仪，上海玻璃仪器二厂;倒置显微镜，日本OLYMPUS;酶联免疫检测仪，第四军医大学。

1.2 方法

1.2.1 新城疫病毒修饰H22肝癌细胞及可溶性抗原的制备参照文献[1]进行。

1.2.2 脂质体的制备及包封率测定 参照我所建立的方法[1-3]略加改进。

1.2.3 瘤苗的治疗实验

1.2.3.1 分组 将60只 BalB/c小鼠随机分为为3组，每组再分为两部分，一部分用于观察生存期，另一部分用来检测淋巴细胞对H22肝癌细胞的体外杀伤效应。第1组为脂质体包裹NDV修饰的H22抗原组(LVAg组)，第2组为脂质体共包裹β-榄香烯和H22抗原组(LEAg组)，第3组为脂质体共包裹β-榄香烯和NDV-H22抗原组(LEVAg组)。

1.2.3.2 免疫治疗程序 第1天各小鼠腹腔接种H22肝癌细胞1.1×106个/0.1 ml，24 h后腹腔接种各种疫苗0.1 ml，每毫升疫苗含3×107个H22肝癌细胞所含的抗原，第一次免疫后一周强化免疫一次。

1.3 淋巴细胞对H22肝癌细胞的体外杀伤试验

1.3.1 脾淋巴细胞悬液的制备 第二次免疫后4 d，将用来检测细胞毒作用的小鼠取出，常规腹部消毒，无菌取脾，DHanks冲洗，玻璃匀浆器匀浆后过200目金属网，淋巴细胞分离液分离、制备淋巴细胞，用培养液调至5×105个/100 μ1。

1.3.2 脾淋巴细胞对H22肝癌细胞的体外杀伤试验 参照黄永年[4]等的方法进行。

1.4 小鼠生存期的观察 每天记录各组小鼠存活数量，从接种之日起，连续观察50 d，存活＞50 d者，认为长期存活。

1.5 统计学方法 用SPSS 11.5软件，应用方差分析ONEWAY-ANOVA对生存期和淋巴细胞毒活性进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KCl法提取的可溶性抗原的蛋白含量 每106个 H22肝癌细胞所抽提的蛋白为107μg，每106个NDV修饰后H22肝癌细胞所抽提的蛋白为119 μg。

2.2 脂质体的包封率 脂质体对LVAg、LEAg、LEVAg的包封率分别39.45%，44.38%和39.45%，对β-榄香烯的包封率为81.36%。

2.3 不同免疫治疗的效应观察

2.3.1 不同的免疫治疗对BalB/c小鼠生存期的影响 对荷瘤小鼠分别用不同的疫苗制剂间隔1周进行连续两次的免疫后，LVAg组、LEAg组和LEVAg组的平均生存期分别为(35.2±5.5)d、(37.8±3.7)d和(45.8±3.8)d，3组间差异有显著性(F=15.823，P＜0.001)，其中，LEVAg组的平均生存期长于LVAg组(P＜0.001)和LEAg组(P＜0.001)，而后二者之间差异无显著性(P=0.197)。

2.3.2 不同免疫治疗组小鼠脾淋巴细胞体外杀伤H22肝癌细胞活性观察 在效靶比为50:1时，LVAg组、LEAg组和LEVAg组的脾淋巴细胞毒活性分别为:(30.0±2.8)、(29.0±1.5)和(46.4±1.9)，3组间差异有显著性(F=210.105，P＜0.001)，其中，LEVAg组的脾淋巴细胞毒活性强于LVAg组(P＜0.001)和LEAg组(P＜0.001)，而后二者之间差异无显著性(P=0.322)。

3 讨论

脂质体包裹可增加抗原的颗粒性，较可溶性抗原更易被抗原提呈细胞吞噬和提呈[5]。巨噬细胞对脂质体具有优先摄取，脂质体包裹的抗原可经巨噬细胞的MHC-Ⅰ途径激活T细胞，发挥主要的抗瘤作用，同时又可经MHC-Ⅱ途径激活CT细胞，T细胞(包括Th细胞)被激活后释放细胞因子，一方面促进激活的T细胞的细胞毒活性，另一方面促进B细胞产生体液免疫，促进机体的抗瘤免疫作用。

病毒用于抗肿瘤免疫治疗最初源于“病毒异种化作用”的概念，即通过使肿瘤细胞表面带有外来病毒相关抗原，增强其免疫原性，易于为宿主的免疫系统识别。NDV是禽类的一种副粘液病毒，对癌细胞具有较强的亲和力，可在癌细胞内大量复制，而对正常细胞影响不大[6]。体外实验中，NDV致敏可显著增加DC-CIK对于胃癌细胞株的杀伤力[7]。在临床研究中，NDV修饰的自体肿瘤细胞疫苗能改善晚期结肠癌患者的生存[8]。

榄香烯为脂溶性的非细胞毒性的广谱抗肿瘤药物，同时又具有免疫增强作用。榄香烯能改变或增强肿瘤抗原的免疫原性，诱发或促进机体对肿瘤的免疫排斥作用[9]。此外，榄香烯能显著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数，增强CONA诱导的小鼠脾细胞的增殖，增加NK细胞的活性[10]。

本研究用NDV修饰脂质体瘤苗，以增强肿瘤抗原的免疫原性，更易为宿主识别，同时用免疫增强剂榄香烯来刺激机体免疫反应，获得了最强的抗瘤免疫效应，显著高于单用NDV修饰脂质体瘤苗和单用榄香烯修饰脂质体瘤苗，提示二者的协同增效作用。免疫效应的增强可能源于榄香烯的免疫增强作用，NDV的抗原异源化作用，以及脂质体包裹后的抗原提呈的作用的加强。共包裹榄香烯和NDV修饰的脂质体肝癌瘤苗有潜在的临床应用价值，为抗肝癌治疗提供有效的补充手段，值得临床进一步研究。

[1]高天慧，段芳龄，刘明月.NDV修饰对H22肝癌细胞脂质体瘤苗免疫作用影响的观察.中华肿瘤防治杂志，2011，18(3):180-182.

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[4]黄永年，李薇.噻唑兰比色法实验条件的研究.中华医学检验杂志，1992，15(4):229-230.

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[6]Ravindra PV，Tiwari AK，Sharma B，et al.Newcastle disease virus as an oncolytic agent.Indian J Med Res，2009，130(5):507-13.

[7]李辉，王震，毛伟征，等.新城疫病毒对胃癌细胞抗原修饰作用的研究.齐鲁医学杂志，2009，24(4):306-308.

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[10]陈龙邦，臧静，王靖华.β-榄香烯对荷瘤小鼠免疫功能的影响.肿瘤防治研究，1998，25(1):54.