清热解毒方改善脓毒症大鼠脏器功能的比较

杨 静，刘洪斌，李东华

天津市中西医结合急腹症研究所（天津 300100）

脓毒症是指由感染或高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，其病原体包括细菌、真菌、寄生虫及病毒等。脓毒症病情凶险，病死率高。近年来，抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，但病死率仍高达30%～70%[1]。本文所研究的清热解毒方由大黄、黄芩、白头翁、败酱草等组成，经过长期的临床和科研应用，具有良好的疗效[2]。本研究重点探讨该方对脓毒症大鼠多器官衰竭的改善作用，进一步探讨其治疗机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康Wistar大鼠88只（由天津市实验动物中心提供，动物饲养合格证为（07311），雌雄各半，体质量（250±30）g。标准颗粒饲料喂养。随机分为7组：正常对照组（20只）、模型组（20 只）、QR1 组（9 只）、QR2 组（9 只）、血必净组(10只)。

1.2 主要实验仪器 流式细胞仪（BD Calibur, 美国），电子天平（SARTORINS,德国）。

1.3 相关试剂 荧光抗体：P-selectin Mouse anti-Human Monoclonal Antibody-LS-C44841，Integrin，Beta 3 Hamster anti-Mouse Monoclonal Antibody-LS-C44643均购自LIFESPAN BIOSCIENCES。

1.4 受试药物 清热解毒方1（QR1）、清热解毒方2（QR2）由华西医科大学药学院提供，批号：201008。该方由大黄、黄芩、白头翁、败酱草等按不同比例配伍而成，定容至相当于3 μg·mL-1生药（配比见表1）。血必净注射剂由红花、赤芍、川芎、丹参、当归等中药材提取物组成，主要成分为红花黄色素A等。

1.5 模型制备与给药方法 实验前12 h禁食、不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉。开腹，分离盲肠，在距其末端2 cm处以1号丝线结扎, 再用18号针头在盲肠末端穿孔, 将盲肠放回腹腔后逐层关腹。连续观察72 h。各给药组于术前1 d 给药，连续给药3 d，1次/d灌胃，剂量为24 μg·kg-1生药。对照组及模型组为等量生理盐水灌胃。

表1 清热解毒方不同成分配比表

1.6 检测指标 治疗72 h，各组动物经腹主动脉取血，部分用EDTA 抗凝，离心分离血清-30 ℃冻存；其余血液肝素钠抗凝。样品制备方法：每管加入荧光抗体各10 μL，抗凝血5 μL，混匀，室温避光孵育15 min，加入PBS 稀释的1%多聚甲醛1 mL，4 ℃静置30 min后进行流式细胞术检测。

1.7 统计学处理 计量资料以均值±标准差(x±sd）表示，数据采用SPSS 11.5统计软件包进行方差分析，采用LSD 法行两两比较，P ＜0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 0～72 h 各组大鼠死亡率 正常对照组大鼠无一死亡；模型组，造模3 d 后死亡率为65%，QR1 组死亡率为11.1%，QR2 组死亡率为55.60%，血必净对照组死亡率为50%。详见表2。由此可见，就提高模型大鼠的存活率而言，QR1 有较好的疗效。QR2组为败酱草缺如组，此结果提示败酱草在清热解毒方改善大鼠存活率方面发挥了重要作用。

2.2 血小板表面蛋白CD62P 的表达 与正常组相比，脓毒症模型组血小板表面颗粒CD62P的表达阳性率有明显的升高，而QR1 在给药的3 d 后可以降低CD62P 阳性血小板的百分率，此效果优于QR2组。详见表3。

表2 治疗后0～72 h各组大鼠死亡率比较

表3 治疗72 h后大鼠血小板CD62P的变化(x±sd）

2.3 肾功能变化 模型组动物在造模后血清中的BUN、Cr 水平较之正常对照组显著增高(P ＜0.05)；各治疗组与模型组相比BUN、Cr的表达水平均有不同程度的降低，治疗组间差异不显著。详见表4。

表4 治疗3 d后大鼠血中BUN/Cr的变化(x±sd）

2.4 肝功能变化 造模后，模型组动物血清中反映肝功能的指标AST、ALT 水平以及AST/ALT 比值较正常对照组均有显著增高(P ＜0.01)；给药以后，各组检测指标都有不同程度的降低：QR1、QR2、血必净组可以明显降低AST水平（P＜0.05)，组间比较血必净组效果最好，QR1 组与QR2 组无统计学差异；QR1组与血必净组可以降低ALT 表达水平，血必净效果较好；给清热解毒方治疗后，各配伍组AST/ALT比值均有所降低，血必净组无此作用。详见表5。

表5 治疗3 d后大鼠血中ALT、AST的变化(x±sd，U/L）

3 讨论

脓毒症是由于机体对微生物感染、创伤或烧伤等反应引起的一种严重综合征，常伴随SIRS和多器官功能障碍。尽管近年来在脓毒症的基础研究和临床治疗上都取得了可喜的进步，但其死亡率仍居高不下。随着病情的进展，脓毒症所导致的各器官可逆性的功能障碍（表现为线粒体摄氧和氧化功能障碍，引起ATP 的合成障碍和快速耗竭）转变为不可逆性器官衰竭是病人致死的主要原因[1]。

中医学认为，脓毒症的主要病因、病机可概括为邪毒入侵(严重感染、中毒、休克等)或各种创伤(外伤、烧伤、烫伤、手术等)导致正邪交争、正气耗伤、邪毒阻滞、正虚邪实。进一步分为毒热证，瘀血证，急性虚证等。目前中医药治疗脓毒症侧重于清热解毒、通腹泻下、活血化瘀等方面[2]。本研究所采用的清热解毒方由金匮泻心汤加减衍化而来，由大黄、黄芩、白头翁、败酱草组成，兼有通里攻下和清热解毒双重功效。血必净注射液由红花、赤芍、川芎、丹参、当归等中药材提取物组成，主治全身炎性反应综合征、多器官功能失调综合征。

大鼠CLP模型是目前公认的临床相关性较强的脓毒症模型。本研究通过此模型的建立，旨在观察清热解毒方对脓毒症大鼠受损脏器如肝、肾以及血液系统的治疗效果，探讨其作用机制，为临床更加合理应用、研发新药提供实验依据。

首先我们着眼于动物的整体生存状态，研究发现，CLP 模型大鼠在0～24 h 的死亡率为35%，24～48 h 内死亡率为46%，48～72 h 内无死亡。给予QR1 治疗后72 h 死亡率为11.1%。与之相反，QR2组以及血必净组死亡率均较高。值得注意的是，各组大鼠的死亡时间主要集中于48 h之内，这说明脓毒症早期所导致的急性炎症反应是导致死亡的重要原因。随着时间的发展以及有效的临床干预，一般认为，脓毒症后期免疫抑制而导致的感染与病程后期病人的死亡密切相关[3]。QR2 组为败酱草缺如组，可见，本实验中败酱草在清热解毒方改善大鼠存活率方面发挥了主要的作用。败酱为败酱科植物黄花败酱、白花败酱的干燥全草；性微寒，味辛、苦；入胃、大肠、肝经；具有清热解毒、消痈排脓、祛瘀止痛之功效。败酱草具有很高的药用价值，主要表现在抗炎方面，如治疗慢性盆腔炎、结肠炎、前列腺炎等。推测其改善生存率的机制很可能与其具有较强的抗炎作用密切相关。

众所周知，活化血小板是血栓的主要成分，也是引起血栓的主要原因。研究发现：脓毒性休克的患者血液流变学和血小板功能均发生异常，随着病情加重血小板功能障碍加剧，血小板功能障碍在MODS发病机制中起更加重要的作用[4-6]。本研究发现：清热解毒方QR1组能够降低血小板CD62P的表达，QR2 组（败酱草缺如组）效果较差，这一变化与大鼠的存活率相对应。推断脓毒症时病原和活化的炎性介质激活了凝血系统，直至出现弥散性血管内凝血与死亡率有着密切的联系，而血液系统的改善与否直接关系了治疗的成败。

国内外研究证实，脓毒症是急性肾损伤的重要的危险因素，同时脓毒症并发急性肾衰将有25．3%的死亡率[7]。更有学者认为，脓毒症大鼠早期就存在有肾功能损害[8]。本研究结果发现，清热解毒不同配伍组都可以有效的改善脓毒症大鼠受损的肾脏机能。

肝脏作为人体的重要组织器官，参与机体的代谢、解毒、排泄、凝血等多种生理功能。血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)是慢性肝病诊断中重要和敏感的检测指标。研究表明，观察两者的变化和比值，对了解肝病的严重程度和判断预后有一定价值[9-11]。本研究中，脓毒症模型大鼠的AST 和ALT 的值显著升高，给药后各清热解毒方组都显著降低了AST/ALT 比值；其中血必净组和QR1(大黄:黄芩:白头翁:败酱草=4:4:6:6)组对损伤的肝细胞有广泛的修复作用，表现为AST水平和ALT 水平显著下降；而QR2 组只降低了AST的表达水平，即改善线粒体的功能；本实验进一步证实了败酱草在清热解毒方中的保肝作用。

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