流式细胞术在临床检验中的应用

张 韫，杨 鑫，李 忻

（中日友好医院临床医学研究所 中心实验室,北京 100029）

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学、流体力学、激光技术、电子计算机技术等高度结合和发展的结晶，是一种在功能水平上对单细胞或其他细胞粒子、抗原物质进行快速检测分析和分选的技术[1]。FCM结合现代单克隆抗体技术，可同时鉴别单个细胞上的多种参数定量定性分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。使用FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。FCM的检测分析已涉及到肿瘤学、免疫学、血液学、微生物学、细胞生物学、遗传学等学科[2]。笔者对FCM在临床检验工作中的应用作一综述。

1 FCM的工作原理及分型

FCM的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统[3]。FCM的特点：①快速，最高每秒可测数十万个细胞；②进行多参数相关测量，可根据测量信息对细胞进行分选。其原理是把经荧光染料标记过的细胞样品制成单细胞悬液，由气压装置送入流动室，流动室由供试品管和鞘液管组成，鞘液管充满流的鞘液，鞘液流与供试品流压力不等，当两者压力差达到一定程度时，鞘液裹挟着供试品流迫使细胞有序地排列成单列，逐个通过喷嘴进人这些染料将在通过激光检测区时受激光束激发，产生散射光和荧光信号，通过一些波长选择通透性滤光片，用不同波长的散射光和荧光信号区分开来。信号的强弱与细胞内待测组分的含量呈正比。荧光信号和散射光信号经过光电倍增管和光电探测器接收后转换成电脉冲，送入计算机处理，应用不同的分析软件可分析样品的各种参数，最后以直方图或二维图的形式显示出来，还可以用不同的荧光标记物进行单参数、双参数、甚至多参数的分析[4]。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征，如细胞大小、DNA含量、细胞表面抗原表达、癌基因蛋白等。

FCM一般分为科研型和临床型两种。科研型FCM功能齐全，分析灵活，但操作比较繁琐，必须由经过正规培训的专业技术人员进行操作；临床型FCM易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验中应用。对某种特征的细胞，还可利用科研型FCM的分选功能将其分选出来，进行培养或其他处理，做更深入的研究[5]。

2 FCM在临床中的应用

2.1 在肿瘤学中的应用

FCM在肿瘤学方面的应用主要是利用DNA含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作。恶性肿瘤的早期诊断是提高治愈率和生存率的关键，良恶性肿瘤的鉴别诊断对于确定临床治疗方案具有决定性作用。迄今为止病理形态学诊断一直被视为肿瘤诊断的“金标准”，但由于某些肿瘤，特别在早期缺乏客观明确的诊断指标，不能提高诊断的正确率[6]。

FCM的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃，特别是用FCM分析细胞DNA含量，分辨率高、精确度好，可为判断肿瘤的生物学行为提供客观而准确的资料，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。癌前病变是指某些具有癌变潜能的病变，正确识别癌前病变对早期诊断和预防恶性肿癌具有重要的实际意义。然而临床上所谓癌前病变所包括的实际上是一大组生物学行为迥异的病变，其中一小部分具潜在癌变可能，而大部分完全是良性病变，因此要用病理形态学手段将其区别开来。只有那些不典型增生或称异型增生的上皮具癌变潜能，为了进一步区别不典型增生上皮癌变潜能的大小，通常根据其增生程度和形成表现将其分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级，分级越高，恶变可能性越大。DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要指标。FCM可精确定量DNA含量的改变，即检测出DNA非整倍体的出现，并将其作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，从而对癌前病变的性质及发展趋势做出评估，有助于癌变的早期诊断[7]。其具体方法是先将实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，再用荧光染料（碘化吡啶PI）染色后对细胞的DNA含量进行分析，最后将不易区分的群体细胞分成3个亚群 （G0/G1期、S期、G2期），DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力证据[8]。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。

FCM不仅可以对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，在肿瘤化疗方面的意义尤为显著。临床工作人员可根据细胞周期各时相的分布情况，结合化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳治疗方案，再依照DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化，及时调整治疗方案，选取有效药物以使对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果[9]。

2.2 FCM在免疫学中的应用

利用抗原抗体特异性反应原理，将不同单克隆抗体设法带上各种荧光染料作为荧光标记（荧光探针），这种荧光探针与单克隆抗体能牢牢结合。当细胞被激光器发射的激光照射后，细胞膜的抗原抗体复合物上的荧光探针可以发射出不同光谱的激发荧光，带荧光探针的单克隆抗体与细胞表面相应抗原的结合的继发荧光量转换成电信号，这就代表了细胞表面的抗原量。这些荧光通过FCM的识别和分辨，从而实现对细胞表面抗原的定量检测[10]。细胞免疫反应一般分2种：（1）直接免疫反应：即细胞表面抗原与带荧光探针的单克隆抗体特异结合的免疫反应；（2）间接免疫反应：细胞表面的抗原与单克隆抗体结合，带荧光的第二抗体又与抗体结合，也使这个抗原-抗体复合物也带上荧光探针[11]。

机体免疫状态是机体是否罹患疾病的重要指标，目前多采用FCM来监测机体的免疫状态，其中最重要的指标是 T、B和 NK淋巴细胞的水平。T细胞主要包括 Th和Ts细胞亚群。CD3细胞代表外周血中总的成熟 T细胞，理论上应约等于CD4+细胞和CD8+细胞的总和。但我们检测患者T细胞及其亚群时，往往出现CD4+加 CD8+细胞之和大于CD3的情况。这是因为CD4+细胞其实包括两部分：CD3+/CD4+细胞（真正的 Th细胞）和 CD3-/CD4+细胞（非Th细胞）；CD8细胞也包括两部分细胞：CD3+/CD8+细胞（真正 Ts细胞）和 CD3-/CD8+细胞（非 Ts细胞）。而CD3-/CD8+细胞又可以分为两组：一组为CD3-/CD8+/CD（16+56）+细胞（即 NK细胞的一部分）；另一组为 CD3-/CD8+/CD（16+56）-（一群未知细胞）。由此可见，真正的 Th细胞是CD3+/CD4+细胞，真正Ts细胞是 CD3+/CD8+细胞。若使用CD4或CD8单标单抗或CD4与CD8双标抗体来检测 Th和 Ts，而不用 CD3抗体进行限定，测出的结果必然会偏离真实值。尤其当患者NK细胞明显增加时，会使CD4细胞和CD8细胞的总和远大于CD3+细胞。因此，一定用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞，然后在 CD3细胞中再区分 CD4+和 CD8+细胞[12]。

自然杀伤细胞（NK），又称裸细胞，因其表面没有类似T细胞和B细胞的表面标志。后来随着免疫力学的发展，发现了 NK细胞的一些表面标志，如CD16、CD56等，但单用 CD16和CD56的抗体无法正确鉴定出 NK细胞，因此必须使用 CD（16+56）抗体。这里还有一点必须引起足够重视，即 NK细胞一定是 CD3阴性表达细胞。所以CD3-/CD（16+56）+细胞才是真正的 NK细胞[13]。

B细胞的表面标志是CD19，理论上CD3-/CD19+细胞才是真正的 B淋巴细胞。但实际检测中，CD3+/CD19+细胞很少，可以忽略不计，所以 CD19+细胞就是 B淋巴细胞[14]。

FCM与单克隆抗体结合，对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得很大的进展，克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估有重要意义。通过检测各种免疫细胞的表面标志及细胞内各种细胞因子等，通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定来监控患者的免疫状态，指导治疗。FCM通过对人白细胞抗原配型的测定可以为异体干细胞移植患者选择出最合适的供体并进行骨髓或器官移植后免疫状态的监测[15]。此外，用FCM检测红细胞、粒细胞抗体及血小板减少性疾病，均有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优点[16]。

2.3 FCM在血液学中的应用

在临床诊断中，一般通过采集血液或者骨髓为标本进行诊断，因为血液或者骨髓的采集比较方便，而且采集的标本呈悬浮状态，易于FCM分析、分选等，因而血液学也是FCM重要的应用领域之一[17，18]。

FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对白血病、淋巴瘤等各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病、淋巴瘤的诊断和鉴别诊断有决定性作用，其诊断的准确性可达到90%左右。微小残留病变 （minimal residual disease，MRD）是白血病复发的主要根源，FCM能在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，及早发现后采取措施避免复发。而且测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。急性白血病的多耐药基因也常用FCM检测，FCM特有的敏感性和特异性，用于检测二氨基苯茚酮mRNA的表达产物P糖蛋白及其活性（作为药物的排出泵,降低细胞内药物浓度），可以更直接的反映耐药程度[19～21]。

网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标。FCM通过某些荧光染料 （吖啶橙等）与红细胞中RNA结合,定量测定网织红细胞中RNA,得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有报道认为FCM比目测法的精确度更高。此外,FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度,对红细胞增殖能力的判断很有意义,为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤患者放、化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据[22，23]。

此外，血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化，借助于钙离子敏感荧光探针的帮助，用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。免疫性血小板减少性紫癜患者血浆中可以产生血小板自身抗体，结合在血小板表面，称为血小板相关抗体（IgG、IgA或IgM分子），用羊抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体标记被测血小板，运用FCM能检测出血小板相关抗体含量。该方法用于该病的诊断及治疗监测具有检测速度快、灵敏度高的优点[24]。

2.4 FCM在临床微生物检测中的应用

FCM快速、灵敏以及可以同时进行多参数分析的优点，使其在临床微生物检测中的作用受到越来越多的关注。通过荧光染料标记，不仅可以检测病原菌、毒素和血清抗体，还可用于抗生素敏感性试验，对抗生素后效应、细菌耐药的异质性等进行分析。FCM既可用于检测受染细胞内的病毒抗原,也可检测受染细胞表面的病毒抗原。利用可特异性识别细胞表面或细胞内抗原的单克隆抗体,FCM可快速检测并定量受染细胞。常用的有直接和间接荧光抗体技术,前者用荧光标记特异性单克隆抗体,后者用未标记的一抗与受染细胞中的抗原结合,然后再将荧光标记的二抗与一抗结合。由于FCM检测的是单个细胞,因此FCM检测受染细胞适用于血液、支气管灌洗液、尿标本以及经酶消化过的组织细胞。同时由于FCM为多参数分析,因此将其用于病毒检测具有以下优点：可在单个细胞中同时获得多个分析参数；能定量检出受染细胞。当用不同荧光染料标记不同的病毒抗原特异性抗体或将特异性病毒抗体与不同大小的乳胶颗粒相联时,FCM可同时检测到同一样本中的多种病毒或病毒抗原。这种方法也可用于真菌、寄生虫、病毒以及这些病原体混合感染的检测[25]。

FCM体外抗生素药敏试验的主要机制是，通过FCM检测染料与病原体结合后发出的不同荧光强度，间接反映病原体的活性和功能状态，进而帮助判断病原体对抗生素的反应性。用于研究抗菌效应的荧光染料主要有2大类：（1）标记DNA和RNA的染料，如碘化丙啶（PI）、溴化乙锭（EB）等；（2）反映代谢活性或结合蛋白的探针，包括膜电位敏感性染料、异硫氰酸荧光素（FITC）等。这些物质的选择与其激发与发射特性有关，同时也与抗生素的作用机制有关[26]。近年来,FCM用于细菌的药敏效应研究已有较大发展,FCM与荧光染料的联合运用可判断细菌活力和功能状态,由于速度快,该方法已被建议用作临床实验室的常规药敏试验[27]。

3 展望

FCM以其分辨率高、分辨细胞数量大、参数多、准确性高、速度快等优点而广泛应用于生物医学研究中，并逐步成为医学临床检验领域中极具发展潜力的高技术平台。随着流式细胞分析技术与方法的迅速发展，FCM在临床的应用范围也不断拓展，并将成为推动临床医学发展的重要手段之一。

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