胶质瘤源性Exosome的研究进展

王立威，孙玉学，张 博，黄海燕，吴宣萱＊

（1.长春市人民医院 伽玛刀中心，吉林 长春130051；2.吉林大学白求恩第一医院 神经肿瘤外科，吉林 长春130021）

脑胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤，有逐年增长的趋势。胶质母细胞瘤患者的平均存活期小于15个月［1］。数十年来，尽管手术治疗、放射治疗以及生物化学治疗在临床上普及应用，但是患者的生存期未见明显延长［2］。1987年，Johnstone等首次用exosome来描述网织红细胞分泌的这种囊性小泡，这种囊性小泡在网织红细胞的最后阶段把不必要的膜成分排除胞外［3］。后来陆续发现 B细胞［4］、T 细胞［5］、树突状细胞［6］、肿瘤细胞均可分泌exosome，肿瘤患者的血清、腹水、胸水等亦有exosome，特别是胶质瘤细胞源性exosome含有 mRNA、miRNA［7］、线粒体DNA、热休克蛋白（HSPs90，70，60和27）、EGFRvIII和 TGF－1［8］等生物大分子，具有重要的研究意义。肿瘤源性exosome含有这些特殊的分子物质，对阐述线粒体疾病有一定的意义，可推动肿瘤的免疫治疗。

1 Exosome概述

Exosome，又称外切酶体、微粒体，起源于晚期核内体，由30－100μm大小的小囊泡在多聚体内（MVBs）聚集而成［9］。多数多聚体被溶酶体酶水解；一部分多聚体与细胞质膜融合释放小囊泡到细胞外，形成exosome。细胞通过释放exosome来排出胞内的毒性物质，包括残留的化学治疗剂，病毒以及信使RNA和微小RNA［10］。Graner，M.W.等已经证实人类与鼠的胶质瘤细胞都可以分泌exosome［11］。在癌症病人的恶性渗出液［12］、腹水［13］以及血清［14］中也存在 exosome。Michael W.Graner［8］等人通过电子显微镜观察发现胶质瘤源性exosome是由50－100纳米的囊性小泡组成的，含有热休克蛋白。Michele Guescini等人研究证实了exosome还有线粒体DNA［15］。下面我们从三个方面来探讨胶质瘤源性的exosome的生物学性质、相应的功能以及对基础医学和临床医学的实践意义。

2 Exosome蛋白质组学研究

蛋白质组学，早在1995年由Marc Wilkins提出这一概念［16］。经过十余年的发展，蛋白质组学已发展为通过双向凝胶电泳、生物质谱技术以及生物信息学等方法在大规模水平上研究蛋白质特征（包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用）的一门学科，用于蛋白质的鉴定，研究蛋白质功能，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。

Hiratsuka等 利 用 2－DE 和 MALDI－TOF－MS技术，在胶质瘤中鉴定出了11种上调的蛋白质和一种下调的细胞骨架相关蛋白－SIRT2。Honda等应用非平衡PH梯度凝胶电泳分离多个胶质瘤细胞系的水溶性蛋白质，结果发现人和鼠的胶质瘤细胞系蛋白图谱存在显著不同。Iwadate等应用2－DE和MALDI－TOF－MS技术对胶质瘤标本进行分析，根据2－DE结果对胶质瘤的蛋白表达谱进行聚类分析，发现聚类分析的结果与病人生存率和生存时间有明显的相关性，进行 MALDI－TOF－MS分析，鉴定了25种蛋白质，分别属于信号转导蛋白、分子伴侣蛋白等。Michael W.Graner等人用二维聚丙烯凝胶电泳研究胶质瘤源性exosome和SMA560vIII源性exosome所含蛋白质［8］，根据其在电解槽中不同的移动速度分离出45种蛋白质，包括HSC90、70、60、27，与免疫相关的抗PDI抗体、肌动蛋白、CD171、CD40、干扰素、白介素6、白介素1，与信号转导相关的DNA／RNA蛋白、转运蛋白、分子伴侣、蛋白酶或者蛋白酶抑制剂，特异的蛋白质包括抑制蛋白2，3－DPGH、凋亡蛋白、CENP－P （#26）、唾液酸合酶、eIF3、PCNA、MT 磷酸酶、EF－1、蛋白酶体和ALIX（一种蛋白质，exosome的标记蛋白）。研究结果显示，其含的蛋白质有的跟人类H2159MG exosome所含蛋白质相同，一部分为其自身所特有。Johan Skog［17］等人通过研究发现恶性胶质瘤患者exosome中含有血管源性蛋白。

蛋白质组学研究显示了胶质瘤源性exosome蛋白质大多数是多功能蛋白质，具有酸性等电点，是与酶及新陈代谢有关的物质。这些蛋白质大部分是低聚复合物，分别是大分子蛋白、TCP－1／HSP60、蛋白酶体、肌动蛋白、微管蛋白、40S的核糖体蛋白、延长因子、转化因子、铁蛋白以及糖酵解中的四种酶。NF－κB和ApoA－1的关系在脂质的新陈代谢中起着重要作用［25］。ApoA－1通过exosome运送到各种细胞或者从细胞中释放，都受控于NF－κB的状态和细胞脂质的生物化学性质。烯醇酶和肌动蛋白是细胞表面血纤维蛋白溶原酶和血管生成抑制因子的受体。烯醇酶和生长因子的关系，说明生长因子可能与糖酵解相关的蛋白有相关性，生长因子对糖酵解有一定的影响。这些蛋白质低聚复合物是由exosome体内的蛋白质聚集而成的。有文献报道，很多病毒蛋白与exosome蛋白相似，很难区分病毒颗粒与exosome。有学者从胶质瘤患者中发现了人巨细胞病毒，在外周血中发现了HCMV DNA［26］。有人推测来自胶质瘤患者的HCMV DNA可能来自exosome，有待研究。

Michael W.Graner等［8］人用Ingenuity软件分析了其蛋白质路径，最高的两种被描述为“血液的、免疫的、呼吸系统的疾病”和“细胞间信号传递、癌症、血液病学的发展”。结果证明，不同来源exosome蛋白质之间有密切的关系，同时有很多信号蛋白存在于肿瘤细胞中，特别是脑肿瘤，并发现很多exosome蛋白与免疫有关，如CD40、干扰素、白介素6、白介素1。这些相关性凸显了exosome存在着正常和病理两种细胞状态。

3 Exosome免疫学研究

通过对胶质瘤源性exosome所含蛋白质的研究发现，其中很多蛋白质是与免疫有关的蛋白质，如HSP、EGFRvII、CD40、干扰素、白介素6和白介素1。

Exosome表面HSP有助于抗原提呈细胞或者自然杀伤细胞的免疫反应；另一方面，细胞表面HSP2724与肿瘤的浸润性生长有关，所以关于exsome表面HSP的研究越来越受关注。HSP27存在于exosome的表面，exosome类似于细胞，细胞表面蛋白能变成exosome表面蛋白。如果exosome能随血液或者脑脊液在体内流动，那么Exosome表面的HSP27，同时也可作为肿瘤表面抗原，亦可作为肿瘤标记。从胶质瘤患者血清中分离出exosome，证明了exosome含有EGFR和EGFRvIII、HSP／HSC70、TGF－＿1。EGFRvIII和 TGF－＿1用于区别是来自肿瘤源性的exosome还是来自病人的血清，亦可作为肿瘤标记。Exosome可以在尿液和羊水中提取，可以用exosome含有的核酸作标记。

从病人和正常人血清中分离出的exosome含有EGFR，而从胶质瘤患者exosome中可发现EGFRvIII，在正常人血清中是不存在的。正常人的exosome含有HSP／HSC70和EGFR，不含EGFRvIII和TGF－＿1。TGF是一免疫调节因子。EGFRvIII这种变异的受体容易被激活而导致癌症的发生，同时可作为肿瘤抗原，引起相关免疫反应［18］。EGFR－vIII和TGF－＿1是胶质瘤所特有的，可作为生物标记，同时它们具有免疫特性，包括抗原性和抑制免疫。EGFRvIII抗原有利于分析胶质瘤产生exosome的过程，也可使我们在体外建立胶质瘤产生exosome的模型。EGFRvIII可以根据相关信号的激活路径转移到不含EGFRvIII的超微小泡中去。

很多报道称肿瘤源性的exosome具有免疫抑制力［19］，TGF在免疫抑制中起重要作用，免疫抑制的靶细胞包括自然杀伤细胞［20］，效应 T 细胞［21］，抗原提呈细胞［22］。高度恶性胶质瘤患者的免疫系统是受到抑制的，推测exosome可能跟免疫抑制有关。免疫抑制和免疫促进的平衡点取决于exosome，免疫反应是由内在和外在的因素共同决定的。Exosome的抗原和免疫刺激是很重要的，但更重要的是免疫调节功能，比如FAS配体、脂肪、病毒，甚至TGF调节因子。Michael W.Graner等［8］人通过对鼠的研究发现，exosome实际上能产生免疫刺激，包括T细胞和抗体的产生，但不能延长鼠的存活期。活体中的exosome能产生抗体。但是，如果很难接近肿瘤组织，或者有一种类似肿瘤的组织来结合抗体，这样就不能起到抗肿瘤的作用。因此，在这种情况下，exosome产生的免疫反应不足以抑制肿瘤的发生。也有报道称exosome能引起保护性抗体反应，抑制肿瘤表达SARS病毒蛋白，这些exosome都来自在经抗病毒免疫的人类细胞株［23］。抗体的产生以及细胞毒性T细胞的减少有益于肿瘤的治疗。胶质瘤源性exosome具有抗炎的作用和产生免疫调节作用，能减少肿瘤免疫反应，能够给我们提供新的治疗方法治疗严重的疾患。

4 Exosome分子生物学研究

Exosome，亦称外切体，是因为在酵母中的exosome具有一个具有3’，5’－外切核酸酶活性的复合物，参与了多条RNA的代谢途径，包括mRNA和pre－mRNA的周转，5.8sRNA的加工，多种snRNA及snoRNA的加工等［28］，在胶质瘤exosome中尚未发现。Johan Skog等［17］人研究证实了恶性胶质瘤患exosome含有 mRNA，miRNA。Michael W.Graner等［11］人在胶质瘤细胞分泌的exosome中发现了与RNA转录有关的起始因子和延长因子eIF3，EF－1。Michele Guescini等人［27］通过PCR技术发现了exosome中含有线粒体DNA，这些与基因有关的分子的发现将会开启胶质瘤新的研究方向。

在胶质瘤中发现对基因研究有重要意义，mRNA和miRNA可作为基因探针或肿瘤标记，有助于胶质瘤的诊断。Exosome中的线粒体DNA有望成为基因克隆的载体，制备肿瘤疫苗，有待于进一步研究。Exosome中是否含有线粒体蛋白质尚不清楚，但Staubach［29］已在乳腺癌exosome中发现了线粒体蛋白质。

4 展望

自从发现exosome以来，人们对它的研究从未间断，希望通过对胶质瘤源性exosome的研究为胶质瘤治疗提供新的方法。目前，树突状细胞性exosome作为细胞疫苗已进入第一临床阶段实验。胶质瘤源性的exosome，是一种亚细胞成分，富含HSP、EGFRvII等多种生物活性分子，在适当的条件下可持续发挥长期稳定的免疫调节作用，由于其体积小，易保存，稳定高效，且为非细胞性物质，集中了DC疫苗和非细胞载体的优势，因而有望取代DC成为一种新的免疫治疗手段，在非细胞性疫苗生物治疗方面前景广阔。Exosome富含各种信号转导分子，可以将相应的信号从胞内带到胞外，引起细胞周围各种信息的交换。在基础研究中，发现exosome含有线粒体及与真核生物有关的转录因子，在解释线粒体疾病、基因转录调控以及克隆方面起到一定的作用。

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