结核分枝杆菌诊断技术的发展及目前临床应用的新型诊断技术产品分析

丰玫玫 苏文琴

1.海口维瑅瑷生物研究院，海南海口 570311；2.海南医学院药学院，海南海口 571199

结核分枝杆菌诊断技术的发展及目前临床应用的新型诊断技术产品分析

丰玫玫1苏文琴2

1.海口维瑅瑷生物研究院，海南海口 570311；2.海南医学院药学院，海南海口 571199

快速准确地诊断出结核分枝杆菌感染是控制和治疗结核病的前提和关键。多年来，结核杆菌的诊断技术在不断地发展和创新，近年来，一些针对结核杆菌检测的新方法陆续被报道，一些新型的诊断技术产品也陆续上市。本资料综述了结核杆菌的主要诊断方法，并对目前国际市场上广泛应用的商业化诊断技术产品进行了简要分析。

结核分枝杆菌；诊断技术；分析

结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺结核最多见。据WHO统计，目前全球有1/3约20亿人被感染，每年新增结核病感染者约800万，至少有300万人死于该病。因此，要有效地控制和治疗结核病，准确的诊断是前提和关键，只有准确、快速地检测出结核分枝杆菌的感染或感染的状态，才能为临床对症治疗提供依据。尽管结核分枝杆菌的诊断技术在不断地发展，检测方法和诊断产品很多，但各有缺点或不足，难以完全满足临床检测的需求，因此，新型结核杆菌诊断技术及产品的研发势在必行。

1 结核分枝杆菌诊断技术的发展

1.1 细菌学检测

结核病的细菌学检测是目前唯一确诊结核病的方法，主要有痰涂片法和培养法。近年来，尽管结核病的诊断技术在不断地创新，但细菌学检验法在结核病的诊疗中仍然占有很重要的位置。

1.1.1 痰涂片法 痰涂片是应用历史最久，也是临床最常见细菌学方法，是发现肺结核传染源的直接手段。主要有抗酸染色法、荧光染色法和联染法，涂片具有快速、简便、价廉等特点，但灵敏度低、特异性差，对早期非排菌感染者的诊断不适用，且诊断结果易受实验室客观条件的影响。

1.1.2 培养法 该方法是通过在培养基上对样本培养，然后根据结核分枝杆菌初生长的时间、菌落形态以及是否产色素等特点，加以诊断，是目前检测结核分枝杆菌的“金标准”，在结核病细菌学诊断方面具有决定性的意义。缺点是周期长，检验结果严重滞后诊断，难以满足临床需要。

1.2 免疫学方法

1.2.1 结核菌素试验 结核菌素试验，也称PPD试验，是一种传统的结核病诊断试验，用一定浓度的结核菌素注射到待检者前臂掌侧皮内，48～72 h后根据注射部位有无硬节，及硬节大小作为结果的判断标准，主要用作结核病的辅助诊断、卡介苗接种效果以及细胞介导的免疫应答反应的检测。反应的出现主要是细胞免疫参与反应，但也有体液免疫参与。该法目前仍在许多国家使用，缺点是假阳性率高、不易标准化。

1.2.2 免疫血清学检测 人体感染结核分枝杆菌后，会产生一系列体液免疫和细胞免疫反应，并明显表现为体液免疫与细胞免疫分离的现象[1]。体液免疫的作用方式是通过效应B细胞分泌抗体，并与相应抗原发生特异性结合来清除抗原，而细胞免疫则是通过效应T细胞分泌细胞因子使靶细胞溶解死亡。

结核杆菌的体液免疫检测既可用已知的结核抗原来测定未知的结核抗体，也可用已知的结核抗体来测定未知的结核抗原，此外，还可以检测免疫复合物。因此，基于体液免疫检测的种类有检测结核抗体、检测结核抗原、检测免疫复合物。

基于细胞免疫反应的诊断技术是诊断结核分枝杆菌感染的新方向，这种技术的产生得益于结核分枝杆菌基因组学和免疫学诊断技术的发展。其基本原理为，机体被结核杆菌感染后，存在于体内的记忆性T细胞会对体外特异性抗原的刺激做出积极反应，表现为特定细胞因子的释放和细胞因子谱的变化。通过对这些细胞因子进行定量分析，达到诊断结核感染状态的目的。这一技术正在结核相关疾病的诊断中显示出其特有的优势，已成为国际上关注的热点，有可能在结核防控领域产生革命性的变革。因为该技术具有高敏感性和高特异性，并且不受卡介苗和大多数非致病分枝杆菌的影响。目前该技术已经在健康人中潜伏性感染风险的评估、免疫抑制人群中潜伏性感染的诊断、免疫治疗前结核杆菌感染的筛查、活动性结核和潜伏性结核的鉴别诊断、活动性结核发病风险预测等临床领域表现出潜在的应用价值，并具有巨大的市场潜力。

目前，应用到临床检测的是γ-干扰素释放分析技术（interferon gamma release assay，IGRA），该技术是对全血或单核细胞在结核杆菌特异性抗原刺激后产生的γ-干扰素进行检测，因为受到抗原刺激而致敏的T细胞再次遇到同类抗原时能产生γ-干扰素，因此可以判断机体是否存在潜伏结核感染。无论是基于体液免疫反应的检测还是细胞免疫反应的检测，所使用的检测方法基本相同，主要有以下几种。

1.2.2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA） 该法是利用抗原与抗体可进行特异性反应的原理，进行定量检测的方法，该法1974年建立。1976年Nassau等首先将ELISA用于血清结核抗体的检测。根据检测原理的不同，可将ELISA分为间接法、夹心法和竞争法3类，是目前较为成熟的血清学辅助诊断方法。但该法会因观察对象、检测抗原的不同质控等因素，结果差异较大[2]。

1.2.2.2 免疫印迹技术 免疫印迹技术，是Southern等于1975年建立的一种特异性抗原、抗体检测技术，是SDS-PAGE技术与高敏感性的酶联免疫技术相结合的产物。1986年Coates SR等[3]首先将免疫印迹技术用于结核病人血清抗体水平的检测，结果表明本法对活动性结核病人的诊断具有很高的价值。

1.2.2.3 酶联免疫斑点技术（ELISPOT） 20世纪80年代中期，Sedgwick JD等[4]和Czerkinsky CA等[5]根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）。该技术可以在单细胞水平上进行细胞因子的检测，对结核病的早期诊断意义重大。由于该方法具有较高的特异性和敏感性，且客观、易操作、易自动化。如果能区分潜伏和活性感染，将具有更高的临床应用价值，但缺点是所用仪器和试剂较昂贵。

1.2.2.4 金标免疫斑点法 该技术是20世纪80年代中后期发展的一种新型免疫学标记和检测技术，九十年代起在结核病血清学诊断中得以应用。免疫金标技术是在免疫斑点检测原理的基础上用胶体金标记替代了酶标记，可以用于定性或半定量检测，由于该法操作简便、快速，并可单人份检测，因此深受欢迎。缺点是不能定量，敏感性和特异性低。

1.3 分子生物学方法

随着分子生物学的飞速发展，其在结核病领域的研究和应用也逐渐深入。结核病的基因诊断、耐药性测定、菌种的分子

生物学鉴定等均取得了重大进展。目前，研究、应用报道较多的方法主要有如下几种。

1.3.1 核酸探针法 核酸探针法的基本原理是利用已知的核酸探针检测结核分枝杆菌核酸样品中的特定基因序列。核酸探针是一项很有前途的检测技术，它可以鉴定不同种群的分枝杆菌，有助于结核病的鉴别诊断。其显著优点是特异性强[6]，缺点是直接检测临床标本的敏感性较低，因此，目前核酸探针法很少用于临床诊断。

1.3.2 PCR技术 1989年Hance AJ等[7]首先将PCR用于结核分支杆菌的检测。PCR是一项良好的实验研究技术，具有快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、可自动化、通量化等特点，这对于因排菌量少或因结核杆菌发生L型变异，常规细菌学方法不易诊断的患者，鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察，具有很高的临床诊断价值。但常规PCR易引起产物交叉污染，结果出现假阳性。为克服PCR检测技术的不足，近年来科研人员对其进行不断创新和发展，新的PCR及其衍生技术不断被建立，如2007年，Agacayak A等[8]研究报道的PCR-RFLP（聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析）；1993年，Higuchi R等[9]报告提出了Real-Time PCR（实时定量荧光PCR），2008年，Takahashi T等[10-11]研究报道的定量巢氏PCR方法等。此外，还有PCR-SSCP技术、PCR-反向斑点杂交技术、PCR-基因芯片分析法、RNA/RNA错配法、分子灯塔法（molecular beacon）、PCR-双脱氧指纹图谱（PCR-ddF）等。尽管该技术具有很多优点，但在临床检测中如果操作不慎，易出现假阳性和假阴性结果，不能区分死菌与活菌。

1.3.3 DNA序列测定 DNA序列测定，是用PCR的方法扩增待测基因，测序后与其标准株的同一片段进行比对。DNA测序是菌种鉴定和检测基因突变的“金标准”，不仅能够用于突变的检测，而且能够确定突变的部位与性质。但该法操作繁琐，费用昂贵，因此限制了它的临床推广应用，目前多用于评价其他检测方法的参考方法或与其他方法结合应用。

1.3.4 基因芯片技术 基因芯片始创于90年代初，又称DNA芯片，是近年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法，是目前分子生物学最前沿的方法。系指将多种探针固定在基片上，与待检标本中标记的DNA或RNA进行分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和序列信息。1999年Troesch A等[12]开发出首块结核病相关芯片。该技术在基因分析时具有快速、准确、高通量、高信息量的优势，在结核分枝杆菌诊断、菌种鉴定、、耐药性分析等方面发挥着重要的作用，但由于仪器昂贵和制备芯片成本偏高因素等限制了其在临床诊断中的广泛应用。

1.3.5 环介导等温扩增技术 2000年日本学者Notomi T等[13]建立了一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，即环介导的等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。该技术依赖于自动循环的链置换反应，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，通过肉眼观察即可判断，而且特异性强、灵敏度高，适合基层快速诊断。受到了WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于多种病菌的检测中，包括结核杆菌的检测，目前已有相关的检测产品上市，有望成为临床上常规的检测技术。

1.4 噬菌体裂解技术

尽管1947年Gardner就分离出了分枝杆菌噬菌体，但用噬菌体裂解法检测结核分枝杆菌还是一个新的领域，该技术的基本原理是：分枝杆菌噬菌体只能感染活的结核分枝杆菌，该噬菌体与待检样品混合孵育后，侵入活的结核分枝杆菌体内，随后加入杀毒剂杀死培养基内所有游离的噬菌体，而侵入结核分枝杆菌内的噬菌体大量繁殖，并裂解菌体释放出来，释放出来的噬菌体可感染和裂解随后加入的指示菌（耻垢分枝杆菌），在培养基上形成噬菌斑，由此只需根据培养基上的噬菌斑的有无，就可判断标本中是否存在活的结核分枝杆菌[14]，而且噬菌斑的数目与结核分枝杆菌的数量成正比。该法可鉴别死、活菌，特别是在结核杆菌药敏感实验方面另辟蹊径。且该方法简单、易操作、仪器设备要求低、成本低廉，易于推广。

2 目前临床应用的新型诊断技术产品分析

随着科技的发展和学科间的交叉应用，世界各国相关领域的科研工作者们在不断地探索，使得结核杆菌的诊断方法得到了不断的改进和创新，许多性能更好、更加方便临床应用的新型结核杆菌诊断技术和产品逐渐上市[15-17]。WHO和FDA也逐步认可了一些性价比较好、且已广泛应用的商业化诊断技术产品，如基于液体培养法的由法国生物梅里埃公司研制的BacT/Alert 3D检测系统、美国BD公司研制的BACTECTM MGITTM960系统、基于核酸分子扩增技术的由瑞士Roche公司研发的Amplicor MTB试剂盒、美国芝加哥Abbott实验室开发出半自动商品化LCR诊断试剂盒、美国Gene-Trak公司研制的全自动QB复制酶扩增包装试剂盒、美国Gen-Probe公司发展起来的Gen-Probe结核分枝杆菌检测分析系统AMTDT、美国BD公司的BDProbeTec SDA系统、美国Cepheid公司依据荧光定量PCR的原理开发的Xpert MTB/RIF系统、澳大利亚ICT公司基于免疫色谱技术的Capilia TB试剂盒研发的ICTTB测试卡；英国Oxford Immunotec公司基于细胞免疫反应的γ-干扰素释放分析技术生产T-SPOT.TB试剂盒和澳大利亚Cellestis公司研发的QuantiFERON-TB Gold、日本荣研公司与FIND合作基于LAMP技术研发的肺结核LAMP诊断试剂盒，还有基于噬菌体裂解技术由英国Biotec Laboratories Ltd公司研发生产的FASTPlaqueTBTM试剂盒。

目前国内通过国家食品药品监督管理局批准上市的结核分枝杆菌诊断试剂盒产品有40多个，这些产品的检测方法主要集中在酶联免疫法、PCR法、胶体金法、基因芯片法等，2011年，国内首款基于γ-干扰素释放分析技术的试剂盒产品也正式上市。

3 结论

由于结核分枝杆菌染色体变异的多样性和多耐药结核杆菌的出现，有时用一种方法难以检测或鉴定出所感染的菌株，因此还需要扬长避短，几种方法联合使用。此外，目前尚无一种诊断技术或产品可严格区分出潜伏性感染和活动性结核，因此更敏感、更快捷、可区分潜伏感染和活动性结核的新型诊断技术或产品的研发，仍然任重道远。

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Advance in diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis and analysis of new diagnostic technologies and products in clinical application

FENG Meimei1SU Wenqin2
1.Haikou VTI Biological Institute,Haikou 570311,China;2.Department of Pharmacy,Hainan Medical College,Haikou 571199,China

Fast and accurate diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection is the key and prerequisite to control and treatment tuberculosis.For many years,the diagnostic techniques of Mycobacterium tuberculosis have been developing and innovating.In recent years,some new techniques for Mycobacterium tuberculosis detection were reported and some new diagnostic products have been listed.This paper reviewed the main diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis,and analysed briefly the commercialized diagnostic products which are used widely in the international market now.

Mycobacterium tuberculosis;Diagnosis;Analysis

R378.91；R446.5

A

2095-0616（2012）12-26-03

2012-04-25）