治疗急性缺血性脑中风神经保护药物研发的进展和展望

戴甲培，冯 斌

(1中南民族大学武汉神经科学与神经工程研究所，武汉430074;2中南民族大学药学院，武汉430074;3中南民族大学生命科学学院，武汉430074)

脑中风是世界死亡率排名第二的疾病，每年死于脑中风的大约为600万人.据估计，人一生中患脑中风的概率为8% ～10%［1］.脑中风一般可分为缺血性脑中风(占所有脑中风的85%)和出血性脑中风(占所有脑中风的15%)［2］.缺血性脑中风的定义是血流减少导致正常细胞的功能改变.大脑组织对局部缺血非常敏感，即使神经元的短时间缺血也会引发一系列的事件，最终导致细胞的死亡.脑组织的损伤通常是由于缺血和血液再灌注引起的复杂联级反应的综合结果.

本文主要从缺血性脑中风的病理生理学机制，治疗药物的研发策略，特别是神经保护药物研究存在的主要问题等方面进行综述和分析.

1 急性缺血性脑中风的病理机制和神经保护药物的研发

脑中风的病理生理包含许多过程:如能量耗散，细胞内离子失衡，酸中毒，胞内钙离子增加，兴奋性神经递质的毒性作用，自由基介导的细胞毒性，花生四烯酸产生，细胞因子介导的细胞毒性，补体激活，血脑屏障被破坏，神经胶质细胞被激活和白细胞渗透等，这些相互关联的事件在缺血的区域会导致脑组织坏死.脑部缺血几分钟后，缺血部位的脑组织血流急剧减少并造成不可逆的伤害，从而导致细胞死亡.坏死的组织被一些受损伤较小的相邻组织包围着，这些组织由于血流的减少而导致功能的沉默，但依然有代谢活性［3，4］.坏死是细胞形态上的变化，包括最初的细胞和细胞器的肿胀，接下来的细胞核、细胞器和质膜崩解，最后细胞内容物流出胞外［3，4］.在缺血早期阶段，缺血半影区占损伤全部体积的一半，这个区域为脑中风后的治疗提供了一个靶向区域［5］.轻度的局部脑缺血，发展比较缓慢，可以激活相关的基因而导致最终的细胞凋亡［6-8］.最近的研究表明，许多缺血区的神经元的细胞凋亡过程要数小时到数天时间，因此它们在脑中风发生后仍然有恢复的可能.与细胞坏死相比，细胞凋亡是一个程序化的和耗能的细胞死亡过程.细胞凋亡是有组织有步骤的分解细胞，并且对周围的细胞的伤害和干扰最小［4］.一般有内部和外部两种激活细胞凋亡的途径.在过去的10年中，实验研究对缺血性脑中风后细胞凋亡过程有了新的认识.

1.1 钙失调和钙稳定剂

细胞缺血性死亡级联反应部分由谷氨酸受体和电压门控钙离子通道(VDCC)激活导致过量的钙流入所介导.另外，Ca2+-ATP酶失效，导致细胞内钙浓度持续增高.阻断谷氨酸受体的药物(如MK-801)和阻断VDCC的药物(如尼莫地平、氟桂嗪)在啮齿动物中风模型中具有治疗效果［9］.最近的利阿诺定受体(ryanodine receptors)抑制剂丹曲洛林(dantrolene)在啮齿动物模型中表现出较好的实验结果，并且开始讨论进行临床实验［10］.

1.2 谷氨酸兴奋毒性和抑制兴奋毒性的药物

谷氨酸是脑内的一种主要的兴奋性递质，它在缺血后积累在细胞外，并且激活各种受体［11］.谷氨酸受体的激活引起细胞内离子浓度的改变，主要是钙离子和钠离子.实验研究表明，谷氨酸的毒性作用主要是由于钙离子的内流引起的［12，13］.此外，细胞内钠离子浓度太高在缺血的开始阶段会危害神经元的存活［14］.

许多抑制谷氨酸受体活化的化合物被用于中风的动物模型实验和人类临床实验.非竞争性的NMDA受体拮抗剂MK-801(地佐环平)在实验动物模型中减少 75% 的缺血体积［15，16］.MK-801 和右美沙芬(dextromorphan，另外一个非竞争性 NMDA受体拮抗剂)在动物模型中也表现良好保护作用，但在临床实验中却因有精神副作用和治疗效果不明显而在早期阶段终止［17］.另外一些非竞争性的(如阿替加奈，纯地蜡)或竞争性的(如塞福太，依利罗地)的NMDA受体拮抗剂在中风的动物模型有很好的效果，但在临床实验中也没有显著的治疗效果［18］.不论怎样，基于抑制谷氨酸兴奋性治疗脑中风的方法还是有一定前景的.例如，最近的研究发现突触后致密物(PSD-95)抑制剂在灵长类动物脑中风治疗中取得了很好的效果［19］.

1.3 细胞凋亡和抑制剂

脑中风损伤中细胞的凋亡最终导致了神经元的死亡.神经元凋亡中关键性的酶是半胱天冬酶［20］.半胱天冬酶是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族中的一员，该家族至少有14个成员，并且可以分为三组(I、II和III).许多科研团体研究广谱型半胱天冬酶抑制剂z-VAD治疗缺血性中风引起的神经退行性症状的效果.半胱天冬酶第I组中的Ac-YVAD-cmk(Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-cmk)在短暂脑缺血性中风模型中表现出神经保护作用［21］.另外，多肽形式的半胱天冬酶抑制剂在脑中风动物模型中能够减少神经元的丢失［22］.不过直到目前为止，细胞凋亡抑制剂还没有进行相关临床试验.

1.4 氧化应激、脂质过氧化作用和抗氧化剂

不断增加的研究证据表明，在缺血脑中风的病理生理过程中，氧化应激和细胞凋亡是紧密联系的现象.许多实验和临床观察表明，不同形式的脑中风自由基的产生都增多［23，24］.脑中风过程产生的自由基包括过氧化物阴离子、氢氧根(OH－)和一氧化氮(NO).自由基一个主要的来源是线粒体，在电子传递链中产生过氧化阴离子［24］;另外一个重要的来源是通过环氧合酶和脂肪氧化酶代谢花生四烯酸产生的过氧化物［25，26］.氧化自由基也可以由小胶质细胞的激活产生，并能在缺血组织再灌注的过程中渗透到周围的白细胞中［27］.这个氧化反应引起进一步的组织损伤，并且被认为是缺血性脑中风后细胞凋亡的一个重要的触发分子.

NO合成酶作用于L-精氨酸生成NO.NO合成酶在一部分神经元中表达，它的合成需要激活钙调蛋白［28］.可诱导的NO合成酶由小胶质细胞和单核细胞等炎症细胞表达.这两种不同来源的NO合成酶在缺血的情况下都会对脑组织产生损害作用.另一种NO合成酶来自内皮细胞，它有扩张血管的作用，并且对促进局部血流是有益的［29］.NMDA受体的激活可以刺激NO合成酶生成NO，这个过程可能在缺血性脑中风由兴奋性氨基酸介导的脑损伤中起到了一定的作用［30］.NO可以在细胞膜中自由扩散，并可与过氧化物反应产生另外一种具有高反应性的过氧亚硝基(ONOO-)［31］.氧化产生的自由基和具有活性的氮化物在脑中风后会激活诸如细胞凋亡、炎症之类的过程导致细胞死亡［32-34］.

脂质过氧化作用在脑中风的发病机理中扮演一个重要的角色.细胞膜脂质过氧化作用引起神经元凋亡的机制包括产生4-hydroxynonenal(4-HNE)，4-HNE能造成Na+/K+、葡萄糖和谷氨酸等细胞膜转运体的损伤［35］.钙离子和自由基在导致损伤的同时，也激活神经保护的转录因子，包括NF-κB、低氧诱导因子-1和干扰素调节因子-1［6］.有些转录因子能诱导细胞炎症因子(如IL-1、IL-6和TNF-α)、趋化因子(如 IL-8和 MCP-1)、内皮细胞粘附分子(如selectins、ICAM-1和VCAM-1)和其他促炎症基因的表达［6，36］.此外，氧的供应减少会通过无氧酵解过程导致乳酸的积累，最终引起酸中毒［37-40］，酸中毒也干扰细胞内蛋白质的生成.

这些自由基导致的损伤可以被抗过氧化酶和自由基清除剂降低［41，42］.很多阻止自由基产生和抑制自由基活性的药物在中风动物模型中表现良好的治疗效果.尿酸是组织和体液中天然的抗氧化剂.注射尿酸能够显著减少缺血性损伤和改善动物行为［43］.依达拉奉(edaravone)，四甲吡嗪(tetramethylpyrazine)，PBN(alpha-phenyl-N-tertbutyl-nitrone)，FR210575，NXY-59 等一些其他的自由基抑制剂在治疗脑中风损伤的动物实验中表现出很好的效果［44，45］.但在已经完成的临床试验中，自由基清除剂只有很有限的治疗效果.NXY-59最早被报道在急性缺血性中风中有效果［46］，但在较大的人群试验中却没有表现出很好的效果［47］.伊普森(Ipsen)研发的EGb-761(Tanakan®)是从银杏树中提取的自由基清除剂［48］，最近已经完成临床3期试验，其治疗效果依然不能十分肯定.

1.5 炎症和抗炎症药物

脑中风引起的炎症特征主要是脑内白细胞的积累和小胶质细胞的激活.大量实验证据表明白细胞在脑中风的发病机理中起到一定的作用.白血球调节再灌注诱导的组织损伤和微血管障碍有3个主要的证据:(1)白血球在缺血后的组织中积累;(2)缺血性脑中风对有中性白细胞减少症的实验鼠损伤较小;(3)用单克隆抗体阻断白细胞-内皮细胞的附着性可减少缺血性脑中风的损伤［37］.因此中性粒细胞与中风有着紧密的联系.在急性脑缺血后中性白细胞附着在血管内皮并且渗透到大脑软组织［49-52］.用抗中性白细胞血清处理的大鼠的大脑中风后梗塞面积减少，同样表明嗜中性白血球的积累在中风的病理过程中起着重要的作用［53，54］.相比较而言，中风后淋巴细胞在脑中的集聚的病理显著性并不十分明显.此外，最近有研究表明T-淋巴细胞在调节缺血性脑中风后的再灌注损伤中有重要的作用［55，56］.然而，淋巴细胞和嗜中性白血球在中风病理生理过程中的相互作用机理还不是十分明确.

大脑中有许多细胞在缺血损伤后会分泌促炎症的调节因子，它们包括内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元.在缺血后的脑组织中转录因子的激活导致细胞内蛋白质水平的升高和内皮细胞粘附分子的表达升高［57-59］.在大脑中引起炎症的主要是小胶质细胞，在中风后的半影区中更是如此［60］.小胶质细胞激活后会产生促炎症的细胞因子以及有毒性的代谢物和酶类［58，61］.除了小胶质细胞之外，星形胶质细胞在中风诱导的炎症中也扮演重要的作用.这些细胞能同时产生促炎症因子和神经保护因子，例如:促红细胞生长素，转化生长因子-β1(TGFβ1)和 Metallothionein-2 等［62］.小胶质细胞和星形胶质细胞产物具有损伤因子和保护因子的双重特性，总的效果在脑中风不同时间点所起的作用不同，一般在缺血损伤数天至数周后保护和恢复作用开始出现［60，63］.这些因素会增加研究脑中风的病理生理学和寻找新的治疗方法的困难.

炎症还参与脑中风再灌注之后血管内聚集物形成［55，49］，这与细胞粘着分子产生有重要的关系，如选择蛋白、整合蛋白和细胞间黏附分子(ICAM)允许内皮的炎症细胞相互作用.用选择蛋白抗体治疗小鼠暂时局部脑缺血性中风使梗塞体积减少70%［64］.抗ICAM-1抗体也能减少梗塞体积，不过只对短暂局部脑缺血性中风有效果，而对永久性局部脑缺血中风没有效果［65］.然而，最近的临床试验用鼠科动物的抗ICAM-1抗体恩莫单抗(enlimomab)增加了神经功能损伤评分和病人的死亡率，后续的研究在老鼠模型上用抗ICAM-1抗体同样发现梗塞面积的增大并且对中风无治疗效果［66，67］.研究者认为对外源大鼠蛋白的免疫激活反应可能最终导致了临床试验的失败和后面的动物模型实验结果无效［67］.最近，抗 CD11b/CD18 试剂 UK-279276 已完成临床2期试验，表明这个化合物是安全的并且耐受性良好［68］.其他靶点包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，它与炎症细胞分子产生和缺血性中风损伤中的细胞死亡有关.SB239063是MAPK抑制剂，它能减少啮齿动物中风模型中的梗塞体积并且改善动物行为.MAPK可以作为治疗中风的替代靶点［69］.

1.6 血脑屏障障碍和其它因素

脑中风后，血脑屏障会增加通透性和降低屏障功能，并且像其他器官中的缺血损伤一样，血管壁基底层会逐渐剥落［70］.大量的证据表明急性缺血性脑中风会增强脑血管内皮细胞和血管外的中枢神经系统细胞的相互作用，也会增强脑血管内皮细胞和血管内细胞的相互作用，而这些作用进而引发损伤过程［36］.最后产生的结果表现为:(1)毛细血管的低通透性;(2)增强血管内细胞的粘附性;(3)促进炎症的发生;(4)促进血栓的形成;(5)降低内皮细胞的屏障功能.这些都是快速而有效治疗需要面对的问题.

另外，实验研究表明缺血性脑中风损伤中存在着一些异常的机制.一种新的中枢神经蛋白Pancortin-2与肌动调节蛋白、Wiskott-Aldrich综合症蛋白verprolin homologous-1(WAVE1)以及Bcl-xL共同形成线粒体相关的蛋白质复合体，该复合体能够减少成人中局部脑缺血损伤的细胞凋亡［71］.

中枢系统神经元表现一些Toll样受体(TLRs)，缺血性脑中风后TLR激活jun-N-terminal kinase(JNK)的促凋亡信号和 AP-1 转录调节因子［72，73］.其他在缺血性脑中风中激活的新型受体包括Notch和 Adiponectin 受体［74，75］.在局部脑缺血性中风中 γ-分泌酶和脂联素(adiponectin)通过它们的细胞表面受体调节信号(分别是NOTCH-1和ADR-1)恶化神经元凋亡［74，76］.

总之，这些结果表明有许多的通路影响中风所导致的后果，对应的就有许多潜在的治疗中风的靶点.

2 目前的治疗方法和药物研究存在的问题

把动物实验结果转为临床应用的基本问题是动物模型中的病理生理过程是否与人类疾病有关联.可能出现的问题是动物模型和人类疾病在解剖学和生理学上的差异，以及损伤的病理生理学差异.所有这些问题都是相互关联的.通常在损伤之前或损伤之后立即实施治疗会得到好的效果.动物模型实验开始之前通常要制定一个实验计划，设计药物实验的整个过程.如果治疗可行，就要从损伤开始时设置不同的治疗时间间隔模拟临床治疗.在动物模型中，最佳的治疗时间(时间窗)是在中风后的15～30 min之内，在损伤3h以后基本上无效.中风之后减少缺血体积最重要的步骤是血管的再通.血管再通可以自然发生，但一般用溶栓药物使其再通.然而，这个过程也可能导致中枢神经系统的再灌注损伤，使临床治疗更加困难.因此，需要关心的不仅仅是缩短从损伤到治疗的时间，也要认识到潜在的其他的病理机制，这些病理机制可能给中风之后带来严重的后果.

3 研发治疗缺血性中风药物的新趋势

缺血性中风导致的脑部组织的损伤是由于各种因素的相互作用而产生，如兴奋性毒性，氧化应激，炎症和细胞凋亡.如上所述，20年的基础研究针对单一中风损伤机制或一种细胞类型获得的研究并应用这些结果进行临床实验都导致失败.脑缺血性中风的复杂机制和针对单一靶点的临床试验告诉我们，单一靶点的神经保护剂治疗脑中风不能取得很好的治疗效果.不断的研究表明，治疗脑中风要一种多效性的方法，能作用于不同的细胞类型和不同的病理机制.中药的多效性和多靶点作用可能是一种治疗中风的选择，孙衍鲲研究了天麻提取物［77］、李秀芳研究了川穹挥发油［78］对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，都取得了一定的成果.但由于其药物作用机制复杂，有待进一步研究和开发.

另外，尽管在动物模型中许多的药物都能阻断导致神经元缺血性死亡的级联反应，但是在人脑中风中却没有发现到有良好效果神经保护的药物.这种在动物模型和临床试验中存在的不一致性可能是由于以下的一些因素:人脑中风的异质性，人和动物脑部形态和功能的区别，中风后临床试验注射药物的时间相对较晚，在动物实验中实验条件能得到更好的控制(如温度，血压等).针对人脑中风异质性的问题，可以用与人更接近的灵长类动物来进行药物有效性评估，最近的一项研究在这方面取得了重要的进展［19］.

4 结语

缺血性脑中风导致的脑组织损伤是由于多种复杂的病理过程之间的相互作用.中风损伤的分子生物学是一个快速的发展的研究领域，在发展的过程中不断发现新的治疗靶点和直接的治疗方法.大量针对不同通路的药物正在被开发.然而，尽管在动物模型中许多的药物都能阻断导致神经元缺血性死亡的级联反应，但是在人脑中风中却没有发现到具有良好效果的神经保护性药物.因而，把动物模型获得的研究结果转换到临床试验研究仍然有许多重要的问题没有解决.

我们认为需要一种开发治疗脑中风神经保护作用药物的新模式.它能针对中风损伤的多个信号通路和不同细胞类型，而不是已经被临床证明不可行的只针对单一信号通路和一种神经元类型.我们称之为脑中风的多靶点治疗.开发新的针对多靶点的药物是未来发展的趋势.

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