Dickkopf-1对肝细胞癌的诊断价值及其研究进展

池肇春

中国海洋大学青岛市市立医院消化内科 (山东青岛，266071)

2012年我国 Shen等［1］首次报告 Dickkopf-1(DKK-1)可与AFP互补提高肝细胞癌 (HCC)诊断率，引起了广泛的反响。DKK-1是从非洲蟾蜍中编码的一种分泌蛋白，由259个氨基酸组成，分子量40000的基因，该蛋白诱导胚胎的头部区，是胚胎时期头部形成的诱导子和Wnt信号传导通路的抑制因子。以后发现许多动物和人也表达DKK-1。其与Wnt传导通路有关。但详细机理尚不十分清楚。Wnt是一个原癌基因家族，与肿瘤发生密切相关。Wnt信号传导通路除DKK-1外，还被许多细胞外蛋白分子调节，包括 Fr2B/FRP、WIFI、Cerberus等。DKK-1除与肿瘤相关外，与许多疾病如骨疾病、药物代谢、神经退行性疾病、皮肤病、动脉硬化、肾病等均有复杂的相关性。本文仅就DKK-1与肝细胞癌的相关性、作用机理与研究进展作一评述。

1 DKK-1与肝细胞癌的相关性及其作用机理［1～4］

DKK-1转录和血清蛋白上调，血清和组织DKK-1水平增高在肝细胞癌的迁移、侵袭和肿瘤生长上发挥功能作用。DKKs是一组分泌型糖蛋白，包含DKK-1～4四个成员。DKKs有一个信号序列和两个富含半胱氨酸的保守区，分别为靠近N端的CYS1和靠近C端的CYS2。人DKK-1由266氨基酸组成，其相对分子量在29kD左右，而糖基化形式的DKK-1在WesternWnt分子杂交检测显示位于35kD位置。Tulact等报道Western分子杂交有时可检测到DKK-1不同的糖基化水平面的条带。对DKKs功能域和DKKs嵌合体的研究显示，Wnt8抑制需要DKK-1和DDK-2的C端与LRP6R的相互作用，而DKK-1的N端部分能对DKK-1和LRP5/6的相互作用起抑制作用。DKK-1是Wnt通路的抑制因子。分泌蛋白Wnt结合细胞表面受体Frizzed，通过β-catenin(β-连环蛋白)的降解复合体解散阻断β-catenin降解途径，促使β-catenin进入胞核与TCF(T细胞因子)结合，启动多种靶基因表达 (有细胞特异性)，其中的c-Myc、cyclin D、Akt等与细胞周期的调控与癌症的发展密切相关，除此之外Wnt发生作用还需要另一个受体LRP5/6，而DKK-1能与通过结合细胞表面受体的LRP5/6、kremen1/2在Wnt通路中起负调控作用。DKK-1表达受p53、MYCN、β-catenin等基因调控，DKK-1在细胞内异位表达能抑制多种肿瘤细胞的增殖，但有时能在促凋亡因子存在时诱发凋亡。DKK-1在一些肿瘤中低表达，而在另一些肿瘤中高表达。DKK-1在不同肿瘤的发生、发展以及转移这几个阶段中的表达和功能表现出复杂多重的差异。间充质干细胞 (MSCs)在DKK-1起关键作用。MSCs通过DKK-1和c-Myc，在肝细胞增殖上发挥作用，而SOX2核心转录因子，在全能的维持上发挥重要作用。新近报告SOX2也在成人干细胞 (ASCs)中表达，但SOX2在ASCs上的作用仍不明了。SOX2又称SRY相关HMG盒基因2，是一个高度保守的转录因子，是SOX基因家族 (分SOX1，2，3)的一个成员，在胚胎发育中起关键性作用。ASCs型抑制研究显示，SOX2抑制结果有细胞生长和毛细血管发育改变，同时有DKK-1表达降低。染色体免疫力沉淀和虫荧光素测定提示，SOX2与DKK-1结合且在转录上有正性调节作用。DKK-1表达在SOX2抑制hMSCs分化畸形，但可能不取消增殖缺陷。细胞增殖受c-Myc调节，而表达也可能被SOX2调控。c-Myc是Myc基因家族的主要成员之一，是一种易位基因和多种形式物质调节的可调节基因，也是一种可使细胞无限增殖使之获得永生特殊化功能，促进细胞分裂的基因，也是一种癌基因，与各种肿瘤的发生发展有关。SOX2直接调节DKK-1表达。Park等［5］指出，SOX2直接调节DKK-1表达，其后果是决定hMSCs分化。SOX2调节也受c-Myc影响而增殖。结果提示SOX2可能有一种特殊功能，通过调节DKK-1和c-Myc控制ASCs的生长和分化。

MSCs抑制肿瘤细胞增殖。Zhu等证实DKK-1被MSCs表达是受 NANOG调节。NANOG于2003年被发现，属于ANTP类，NK基因家族，NANOG基因属同源盒基因，是胚胎干细胞自我更新所必需的基因，NANOG缺失导致胚胎干细胞 (ES)分化，在调节干细胞的增殖中发挥重要作用。该因子可维持ES自我更新及全能性，对癌细胞增殖有抑制作用。

Kim等［6］发现碳酸酐酶9(CA9)调节肿瘤细胞迁移和侵蚀，而DKK-1像是一个新的CA9相互作用蛋白。在试管内发现CA9 N末端域参与DKK-1的缬氨酸-酪氨酸作用，同时发现在肿瘤发生上DKK-1抑制CA9的内皮细胞血管生成，而且抑制由CA9介导引起的mTOR(一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶)磷酸化，提出DKK-1在肿瘤生成上的一个新作用。

Wnt本身是原癌基因，当突变时可促进肝细胞增殖和转化，当突变或过表达引起肿瘤形成，p53是抑癌基因，当p53功能丧失可加速Wnt引起肿瘤的发生。Wang等［7］发现DKK-1是被野生型p53引起，结果指出，p53介导DKK-1拮抗Wnt信号途径。

如上所述DKK-1的表达受p53调节。将携带p53基因的复制缺陷型腺病毒载体 (Adp53)导入到p53缺失的人的瘤细胞株Hep3B中，以RT-PCR技术检测p53对DKK-1表达的调节作用，结果表明DKK-1 RNA在转录p5320小时后即有明显增加，其中32小时达最高水平。提示p53能调节Wnt通路抑制因子DKK-1的mRNA表达。

2 DKK-1对HCC的诊断价值与临床应用

近年的研究显示，HCC患者血清DKK-1水平增高，可作为血清标记用于HCC诊断，还具有监测HCC复发转移的能力，同时发现血清DKK-1水平与HCC患者肿瘤直径、Edmondson-steiner分级及静脉浸润等密切相关。2012年我国Shen等［1］在柳叶刀肿瘤杂志发表DKK-1的研究报告，作者通过设立HCC、慢性HBV感染、肝硬化和健康对照组，用ELISA测定血清DKK-1，用ROC(接收机操作特征)计算诊断准确性，对831份血清标本 (试验组)进行评估。其中HCC 424例，慢性HBV感染98例，肝硬化96例和健康对照组213例;验证组453份:HCC 209例，慢性HBV感染73例，肝硬化72例和健康对照组99例。结果HCC血清DKK-1比对照组有显著增高。ROC曲线提示最佳诊断值为2.153ng/ml，试验组敏感性和特异性分别为69.1%和90.6%;验证组分别为71.3%和87.2%。对HCC AFP阴性患者可达到精确诊断，试验组敏感性和特异性分别为70.4%和90.5%;验证组分别为66.7%%和87.2%。HCC患者DKK-1血清浓度升高可与慢性HBV感染、肝硬化鉴别，若DKK-1和AFP联合测定可进一步提高诊断准确率。DKK-1在HCC诊断上补充AFP测定的不足，改善AFP阴性HCC患者的确诊率，有助于HCC与非恶性慢性肝病的鉴别。

Qin 等［8］研究 DDK-1 和 Wnt/β-连环蛋白途径在HCC细胞增殖和迁移上的作用。cDNA芯片提示，24基因与肿瘤H7402和M-H7402细胞之间不同的表达有关。Western分子杂交分析有β-连环蛋白、c-Myc和周期素D1表达上调，但在M-H7402细胞DKK-1和nm23基因是戏剧性下调，提示两种细胞系在伴有转移的分子事件上有显著不同。目前已知人类的nm23基因主要有8型，其中主要是 nm23-H1和nm23-H2，这两个亚型定位在人类17号染色体上，紧靠p53位点，被认为是许多肿瘤形成的基因定位，并且是容易发生等位基因杂合性缺失的热点区域。DKK-1过度表达被转染可有力地下调c-Myc和周期素D1的表达，同时也抑制M-H7402的生长和迁移，在H7402细胞被核糖核酸干扰时，DKK-1表达减少，但也有能力使β-连环蛋白、c-Myc和周期素D1的表达上调，也启动β-连环蛋白转位从细胞浆进入细胞核，并增加细胞的迁移。结论是DKK-1/Wnt/β-连环蛋白级联在转移过程介导HCC细胞的增殖和转移。

到目前为止DKK-1在肝细胞癌上有3方面的应用:①诊断标记:血清DKK-1测定，对肝细胞的诊断其敏感性和特异性高，尤其对AFP阴性的患者也可作出诊断，如果与AFP联合检测可提高诊断率;由于其他肿瘤和其他疾病如骨疾病、一些炎症、神经退行性疾病等鉴别也可表达增高，故诊断时应认真做好鉴别;②鉴别诊断:AFP＞20ng/ml时可与慢性乙型肝炎和肝硬化鉴别;③预后判断指标:放化疗、手术治疗或其他保守治疗后动态观察DKK-1的变化，有助于判定疗效、了解有无复发和转移，可作为评估预后的指标。

［1］SHEN Q，FAN J，YANG XR，et al.Serum DKK-1as a protein biomarker for the diagnosis of hepatocellular carcinoma:a large-scale，multicentre study ［J］.Lancet Oncol，2012，Jun 25［Epub ahead of print］

［2］ZHOU XL，QIN XR，ZHENG XD，et al.Downregulation of Dickkopf-1 is responsible for high proliferration of breast cancer via losing control of Wnt/beta-catenin signaling ［J］.Acta Pharmacol Sin，2010，31(2):202-210.

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