肿瘤相关基因 N-myc、Fas、MTA1、nm23-H1对子宫内膜癌细胞增殖转移的影响

黄守国，秦杰，陈瑾，程虹，蒙秋，张静，王海燕

目前对肿瘤相关基因的研究已从肿瘤发生机制向转移机制方向发展。某些原癌基因及抑癌基因不仅在肿瘤发生中起重要作用，且在肿瘤转移过程中也有一定影响。癌基因的激活与抑癌基因的失活均可使细胞生长与分化的调节失控，导致细胞持续分裂和癌变。恶性肿瘤的侵袭和转移是衡量其恶性程度的主要因素，是一个由多基因控制的、受多因素影响的、多阶段多步骤的复杂过程，涉及癌细胞异常的增殖、黏附、迁移，细胞外基质降解及血管生成等一系列病理生理活动。已有大量的试验证明肿瘤的发生和转移与多种控制细胞周期和细胞增殖转移基因的表达失调相关［1-4］。为了解控制细胞周期和细胞增殖转移基因对子宫内膜癌细胞增殖转移的影响，本研究利用实时荧光定量RT-PCR技术检测子宫内膜癌及正常子宫内膜组织标本中 N-myc、Fas、MTA1、nm23-H1基因的表达情况，并进行对比分析，以期在基因水平探讨子宫内膜癌细胞增殖转移的本质。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例标本取自我院妇科2009年1月至2011年1月的住院患者，年龄25～65岁，平均年龄(47.38±12.35)岁。其中，非子宫内膜癌患者正常子宫内膜组织30例，子宫内膜癌患者(均经病理确诊)子宫内膜癌组织60例，根据术后病理检查是否有子宫外转移分为转移组和未转移组各30例，均取活体新鲜组织于－80℃冰箱保存。患者手术前均未进行化疗、放疗、生物治疗等其他治疗，排除其他系统合并症及其他系统肿瘤等。

1.2 主要仪器与试剂 MJ OPTICON2型荧光PCR仪(BIO-RAD，美国);Taq酶(TAKARA，日本);ReverTra Ace-α-反转录试剂盒(TOYOBO，日本);PCR扩增引物:N-myc、Fas、MTA1、nm23-H1 及 β-actin 的mRNA由上海英骏生物技术有限公司合成，设计引物探针所用软件为Primer express 2.0;常规的化学试剂均为分析纯。

1.3 引物探针 基因序列为，h β-actin forward:5'GGA TGC AGA AGG AGA TCA CTG 3';h β-actin probe:FAM-CAG GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT TCATTGTGC-BHQ1;h β-actin reverse:5'CGA TCC ACA CGG AGT ACT TG 3';h N-myc forward:5'CCA AGC CAG TTC CAT TAA AT3';h N-myc probe:FAMCAG GAG TCA GAT TCC AGG TTT ATG T-BHQ1;h N-myc reverse:5'GTC AGG AAT TTC AGT AAC ATT G3';h Fas forward:5'CAT CAT GAT GGC CAA TTC TGC C3';h Fas probe:FAM-CCT GTC CTC CAG GTG AAA GGA AAG C-BHQ1;h Fas reverse:5'TCT GGT TCA TCC CCA TTG ACT G3';h MTA1 forward:5'CCT ACC TGC CCA TCA ACA GCG C3';h MTA1 probe:FAM-CCA TCA AGG CCG AGT GCA CGG CGCBHQ1;h MTA1 reverse:5'TCA GCA CCA GCG GGC TCT G3';h nm23-H1 forward:5'TTT GAG CAG AAA GGA TTC C3';h nm23-H1 probe:FAM-TGT TGG TCT GAA ATT CAT GCA AGC TTC C-BHQ1;h nm23-H1 reverse:5'AAC GTA GTG TTC CTT GAG3。

1.4 人子宫内膜(癌)组织总RNA的提取 (1)从超低温冰箱中取出人子宫内膜(癌)组织样本，迅速剪下约0.25 g的样品，置于预先加入200 μL RNAiso Plus的1.5 mL EP管中。(2)在 RNAiso Plus溶液中破碎人子宫内膜(癌)组织，补充800 μL RNAiso Plus，混匀。在冰上静置5min，再加入200 μL氯仿，盖紧后剧烈振荡15 s(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待溶液充分乳化后，在冰上静置5min。(3)4℃，13 000 rpm高速离心样品15 min后，将上层水相移至新管中，然后加入等体积的异丙醇，冰上放置10 min，4℃ ，13 000 rpm离心10 min。(4)弃上清液，用1 mL 75%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，来回颠倒数次后，以4℃，13 000rpm离心5min。(5)弃上清液，空气干燥RNA 10 min，用 20 μL DEPC 水溶解，立即取 2 μL RNA做反转录，剩余18 μL－80℃冻存。

1.5 逆转录反应 抽提的总RNA进行反转录，取2 μL RNA模板做逆转录反应。反应步骤为:(1)RNA 的热变性，25 pmol/μL random primer 1 μL，RNase Free 水 9 μL，RNA 2 μL，总共12 μL，于 65℃水浴5 min后迅速在冰上冷却2 min，简短离心收集反应液。(2)反应液配置，第一步变性后的RNA溶液 12 μL，5 × RT bμffer 4 μL，dNTP mixtμre(各 10 mmol)2μL，RNase Inhibitor(10 U/μL)1 μL，Rever Tra Ace 1μL。(3)反应程序为30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

1.6 荧光定量PCR反应 配制反应体系共25 μL:10 PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol dNTP 2 μL，dH2O 16 μL，15 pmol/μL 引物(1+1) μL，15 pmol/μL 探针 0.3 μL，5U/μL Taq 0.2 μL，Template 2μL。PCR buffer成分:100 mM Tris-HCl(pH 值 8.3)，500 mM KCl，15 mM MgCl2。反应过程:94℃ 2 min，94℃ 5 s，55℃ 30 s，共40个循环。读取FAM荧光数值，30℃5s。样本同一个检测指标基因统一上机，每个标本分别做4个待检测基因以及内参β-actin的荧光定量PCR。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，基因表达量采取随机独立样本的方差分析及两两对比的LSD-t检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 N-myc基因在各组标本中表达量的比较 由表1可知，原癌基因N-myc在子宫内膜癌未转移组中表达量明显高于正常子宫内膜组织(F=31.478，t= －6.049，P=0.000);在子宫内膜癌转移组中表达量明显高于正常子宫内膜组织(F=44.770，t=－5.638，P=0.000);在子宫内膜癌转移组中表达量明显高于未转移组(F=40.643，t= －5.309，P=0.000)。

表1 N-myc基因在三组标本中表达量的比较

2.2 Fas基因在各组标本中表达量的比较 由表2可知，抑癌基因Fas在子宫内膜癌未转移组中表达量明显低于正常子宫内膜组织(F=18.948，t=5.622，P=0.000);在子宫内膜癌转移组中表达量明显低于正常子宫内膜组织(F=20.760，t=6.024，P=0.000);在子宫内膜癌转移组中表达量明显低于未转移组(F=11.335，t=4.979，P=0.001)。

表2 Fas基因在各组标本中表达量的比较

2.3 MTA1基因在各组标本中表达量的比较 由表3可知，肿瘤转移促进基因MTA1在子宫内膜癌未转移组中表达量明显高于正常子宫内膜组织(F=38.203，t= －10.132，P=0.000);在子宫内膜癌转移组中表达量明显高于正常子宫内膜组织(F=42.035，t= －5.881，P=0.000);在子宫内膜癌转移组中表达量明显高于未转移组(F=39.004，t=－5.488，P=0.000)。

表3 MTA1基因在各组标本中表达量的比较

2.4 nm23-H1基因在各组标本中表达量的比较

由表4可知，肿瘤转移抑制基因nm23-H1在子宫内膜癌未转移组中表达量明显低于正常子宫内膜组织(F=16.644，t=6.181，P=0.000);在子宫内膜癌转移组中表达量明显低于正常子宫内膜组织(F=18.431，t=6.815，P=0.000);在子宫内膜癌转移组中表达量明显低于未转移组(F=45.018，t=12.232，P=0.000)。

表4 nm23-H1基因在各组标本中表达量的比较

3 讨论

子宫内膜癌是最常见妇科恶性肿瘤之一，是女性患者的主要死因之一。近年来子宫内膜癌的防治已取得较大的进展，使子宫内膜癌的发病率明显下降，但有关子宫内膜癌发生及转移的基因机制还未明确。因此，寻找子宫内膜癌早期诊断的基因指标及有效治疗子宫内膜癌的方法，进一步明确子宫内膜癌发生、发展的分子生物学以及基因表达机制成为当前研究热点。

凋亡是细胞区别于坏死的、主动的、程序化的细胞死亡，是一系列凋亡促进基因与抑制基因表达及相互作用造成细胞生存和死亡之间的选择。N-myc基因作为一功能甚多的细胞凋亡抑制基因，通过表达产物发挥多种生物学效应。其在正常细胞中表达极低甚至不表达［5］。Fas是一种分子质量为48ku的I型跨膜蛋白，属于 TNF超家族。Fas配体(FasL)是一种分子质量为40 ku的Ⅱ型跨膜蛋白，也属于TNF超家族。Fas与FasL结合相互作用是引起细胞凋亡的主要途径之一。肿瘤浸润淋巴细胞后激活淋巴细胞表达FasL，两者特异性结合导致靶细胞内源性自杀程序激活，细胞凋亡［6］。本研究发现，原癌基因N-myc在子宫内膜癌组织转移组与未转移组中的表达量均高于正常子宫内膜组织，且该基因在子宫内膜癌转移组中表达量明显高于未转移组，由此说明，N-myc基因与子宫内膜癌细胞的增殖及转移呈正相关，即该基因促进子宫内膜癌的形成，对转移亦有促进作用，但具体的作用机制有待进一步研究。抑癌基因Fas在子宫内膜癌组织转移组及未转移组中表达量均低于正常子宫内膜组织，且该基因在子宫内膜癌转移组中表达量明显低于未转移组，由此说明，Fas基因表达量降低与子宫内膜癌的发生相关，与子宫内膜癌的转移亦相关。

肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤，通过各种转移方式，到达继发组织或器官后得以继续增殖生长，形成与原发肿瘤性质相同的继发肿瘤的全过程。随着分子生物学技术的进步，提出了肿瘤转移机制的全新理论，即基因调控下多元体系。肿瘤的转移是癌基因与抑癌基因参与凋节的复杂过程，通过肿瘤转移相关基因的过度表达，以及一系列基因产物的参与，对肿瘤转移全过程进行调控。nm23基因是从K-1735鼠黑色素瘤细胞株中用消减杂交法分离出来的一种与恶性肿瘤转移有关的基因，即肿瘤转移抑制基因。人类nm23基因有两个亚型即nm23-H1、nm23-H2。发生淋巴转移的恶性肿瘤与未发生淋巴转移者相比，nm23-H1的表达水平明显降低，未发生淋巴转移的恶性肿瘤的nm23-H1表达阳性率明显高于发生淋巴转移者［7］。MTA1基因是从大鼠乳腺癌细胞系13762NF细胞中分离发现的，MTA1基因以共价修饰组蛋白、编码转录因子、参与信号传导途径、调节有关基因的表达等方式，调节细胞的生长，影响肿瘤细胞的转移。在MTA1过度表达的肿瘤一般均表现为深的浆膜层肿瘤浸润度、高的淋巴结肿瘤转移率和显著的血管肿瘤侵袭性［8］。本研究发现，肿瘤转移促进基因MTA1在子宫内膜癌组织转移组中的表达量明显高于未转移组，且该基因在子宫内膜癌组织中的表达量明显高于正常子宫内膜组织，由此说明，MTA1基因的过表达与子宫内膜癌细胞转移相关，并与子宫内膜癌的发生有关。肿瘤转移抑制基因nm23-H1在子宫内膜癌组织转移组及未转移组中呈升表达，同时在子宫内膜癌组与正常子宫内膜组相比较中，该基因亦呈升表达趋势，由此说明子宫内膜癌的细胞转移及增殖与nm23-H1基因表达均成负相关。

总之，通过本实验发现，肿瘤相关基因体系可作为子宫内膜癌早期诊断与监测的基因指标，亦可作为子宫内膜癌发生、发展及临床治疗的监测指标，但其具体作用机制及临床应用价值有待进一步研究。

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