卵巢癌组织中HE4表达及与其临床病理因素的关系

王丹丹 李燕华 张 競

卵巢癌(ovarian carcinoma)是女性生殖道常见的恶性肿瘤之一，尽管其发病率在女性生殖系统肿瘤中居第三位，但死亡率却居第一位[1]。随着宫颈癌、子宫内膜癌诊断和治疗的不断进展，卵巢癌已经成为严重威胁女性生命的恶性肿瘤之一，并且卵巢癌发病率呈现逐年升高的趋势[2]。大部分卵巢癌患者确诊时已至晚期,仅有25%的患者早期被发现[1]，晚期卵巢癌患者5年生存率较早期患者低，约从95%降至20%～30%[3]。因此，许多学者正致力于寻找比CA125更为有效，更为敏感的肿瘤标记物，应用于卵巢癌的早期诊断中。

人附睾蛋白4(HE4，又名WFDC2)基因的cDNA最早由Kichhoff等[4]首先从附睾的上皮远端分离出来，是1种可能与精子成熟度有关的蛋白酶抑制剂。HE4基因位于染色体20q12～13.1上，全长为12 kb左右，由5个外显子和4个内含子组成[5]，HE4的功能尚不确定。目前已有大量研究表明HE4在卵巢癌早期诊断中的价值明显优于CA125[6～11]。

目前，国内外关于HE4在卵巢癌中的相关研究大多集中于血清学方面，而有关组织中HE4表达情况的研究较少。本研究采用免疫组织化学技术，检测正常卵巢组织、上皮性卵巢良性肿瘤组织及卵巢癌组织中HE4阳性表达及其与卵巢癌临床分期、细胞分化及淋巴结转移的关系。探讨HE4在卵巢癌组织中的表达情况及其与卵巢癌发生、发展、侵袭、转移的关系，从而为卵巢癌的诊疗及评估预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本

标本来源于2008年1月～2010年7月蚌埠医学院第一附属医院肿瘤妇科收治的87例患者；包括首次治疗(术前未行放、化疗)并行手术切除的卵巢癌患者47例，上皮性卵巢良性肿瘤20例(浆液性囊腺瘤14例、黏液性囊腺瘤6例)，同时选取20例正常卵巢组织作为对照。所选病例均有完整临床资料及存档蜡块。随访截止日期为2011年11月，随访时间为7～46个月。

1.2 临床资料

47例卵巢癌患者，年龄30～68岁，平均年龄52.25岁，≥52岁30例，<52岁17例；非卵巢癌患者年龄15～77岁，平均年龄39.29岁。根据UICC 2002版PTNM病理分期标准进行分期，早期(FIGOⅠ/Ⅱ期)卵巢癌28例，中、晚期(FIGO Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌19例；高分化20例，中、低分化27例；术后经病理检查证实淋巴结转移者29例，无淋巴结转移者18例。上皮性卵巢癌患者术前3个月内均未接受任何激素治疗，未行化疗或放疗。复阅上述患者的病理切片，选取存档标本石蜡块进行切片，厚度4 μm。

1.3 试剂

鼠抗人HE4多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。S-P免疫组化试剂盒(通用型二步法试剂盒)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。试剂盒组成：试剂(无色液体)，3%去离子水过氧化氢溶液6 ml；试剂A(无色液体)，封闭用正常山羊血清工作液6 ml；试剂B(黄色液体)，生物素标记兔抗山羊IgG二抗工作液6 ml；试剂C(橙色液体)，辣根酶标记链霉卵白素工作液(S -A/HRP)6 ml。DAB Kit(20 X ) (ZLI-9032)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。包括试剂A：浓缩缓冲液(20 X) 3 ml；试剂B：浓缩DAB溶液(20 X) 3 ml；试剂C：浓缩过氧化氢溶液(20 X) 3 ml。

1.4 主要仪器设备

切片机(德国Leitz产1512型)；摊片、烤片机(湖北孝感产CS-D型)；隔水式电热恒温培养箱(上海市医疗器械厂产品)；微波炉(日本松下)；显微镜(日本Olympus)；显微摄影显微镜(日本 Olympus)。

1.5 方法

1.5.1 载玻片处理 取玻片200张，置清洁液中浸泡14 h。取出玻片用自来水冲洗后，置60℃烤箱中烘干备用。

1.5.2 标本切片制备 标本均用术后10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋。每例蜡块连续切片3张，厚4～5 μm，二甲苯脱蜡，无水乙醇脱水，放入60℃烤箱中至少2 h以上。1张行HE染色，其余2张备染。

1.5.3 S-P法染色步骤 石蜡切片经水化后，用PBS(pH 7.4)冲洗3 min×3次。每张切片加一滴过氧化物酶抑制剂，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育20 min。抗原修复：将标本放置在修复液(枸橼酸盐缓冲溶液pH 6.0，95℃，10 min)中，用微波炉高火加热10 min，室温下自来水冷却10 min。PBS冲洗3 min×3次。去除PBS液，每张切片加1滴非免疫性动物血清，室温下孵育20 min，减少非特异性背景，不必冲洗，吸去多余血清。每张切片加1滴一抗，4℃冰箱中过夜。PBS冲洗3 min×3次。去除PBS液，每张切片加1滴生物素标记的二抗，室温下孵育20 min。PBS冲洗3 min×3次。去除PBS液，每张切片加1滴链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液。室温下孵育20 min。PBS冲洗3 min×3次。去除PBS液，每张切片加2滴新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察3～10 min，阳性染色为棕黄色。显色完成后，自来水冲洗，苏木精复染，酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。实验步骤严格按照说明书进行，阳性对照片由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，阴性对照片除用PBS代替一抗外，其余步骤相同。

1.6 判断标准

实验组和对照组均由我院病理科资深医师，在相同条件下观察每张切片并作出判断。HE4免疫组化阳性染色为肿瘤细胞胞质内出现棕黄色颗粒或团块。判断方法：采用二次计分法，每例标本随机计数5个高倍视野(×400)，计数每个高倍视野中阳性细胞百分比并计分。首先按染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再按阳性细胞百分比计分，0分为阴性，阳性细胞数<10 %为1分，11 % ～ 50%为2分， 51% ～ 75 %为3分， >75 %为4分。上述两项得分的乘积作为最终结果，积分≤ 2为阴性表达，>2为阳性表达。

1.7 统计学处理

应用SPSS13.0统计软件，采用χ2检验及相关分析的方法对数据进行分析处理。

2 结果

2.1 正常卵巢、上皮性卵巢良性肿瘤及卵巢癌组织中HE4表达情况

HE4主要表达于卵巢上皮组织细胞胞质中，细胞核不着色，镜下可见胞质中棕黄色颗粒均匀分布或粗细不等散在分布。正常卵巢组织中HE4蛋白表达阳性率为0(0/20)，上皮性卵巢良性肿瘤组织中其表达阳性率为10.0%(2/20)，卵巢癌组织中其表达阳性率为74.5%(35/47)。三组间两两比较显示，卵巢癌组织其阳性表达率明显高于正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织，差异有统计学意义(P均<0.01)。正常卵巢组织与卵巢良性肿瘤组织HE4表达阳性率比较无明显差别，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3种组织中HE4表达情况(例)

注：△为与正常卵巢组织比较；※为与卵巢良性肿瘤组织比较；☆为与卵巢癌组织比较

2.2 HE4表达与卵巢癌临床病理因素的关系

HE4表达阳性率中、晚期(Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌者显著高于早期(Ⅰ/Ⅱ期)者(P<0.01)；中、低分化者其表达阳性率显著高于高分化者(P<0.05)；淋巴结转移者其表达阳性率也显著高于无淋巴结转移者(P<0.05)；HE4表达阳性率与卵巢癌患者年龄无关(P>0.05)，见表2。

表2 HE4表达与卵巢癌临床病理因素的关系(例)

3 讨论

3.1 HE4的生物学特性

HE4(human epididymis gene produet4)，人附睾蛋白4，其基因[5]位于染色体20q12～13.1上，全长为12 kb左右，由5个外显子和4个内含子组成，并存在多种剪切方式，其编码的小分子分泌型蛋白与细胞外蛋白酶抑制剂有很高的同源性，从蛋白结构上讲是1种由乳清酸性蛋白(WAP-type fourdisulphide core protein,WFDC)基因编码的相对分子质量是3 kD的分泌型糖蛋白，是蛋白酶抑制剂家族(具有保护性免疫作用)中的一员,该基因有多种剪切方式，可以编码分泌小分子量的蛋白[12]。HE4 的生物学功能尚不清楚，它是否同家族中的蛋白酶抑制因子一样具有蛋白水解酶抑制作用，还有待进一步研究证明。生物信息学分析结果提示：HE4基因的转录起始点位于翻译起始密码子ATG上游-28位C，HE4基因的启动子中没有经典的TATA box和CCAAT box，该启动子可能是1个TATA-less启动子[13]。赵莹珺等[14]利用转染和荧光素酶报告基因等方法对人HE4 基因启动子区开展了系统的分析，阐明了HE4基因的转录活性主要是由转录因子Sp1 与位于-71和-48的Egr-1位点结合所介导。在转录调控层面上进一步论证了HE4在卵巢癌组织中的高表达，有望被论证为1种高灵敏度和特异性的卵巢癌标志物，也为HE4在卵巢癌靶向性基因治疗中提供了一定的理论依据，HE4基因有望成为控制肿瘤生长、转移及治疗肿瘤的新靶点，为卵巢癌的治疗开辟了新途径。

3.2 HE4在卵巢癌组织中的表达

目前，国内外关于HE4在卵巢癌中的相关研究大多集中于血清学方面，而关于组织中HE4表达情况的研究较少。目前报道[15～19]显示HE4在93%浆液性卵巢癌和100%子宫内膜样卵巢癌中呈高表达，在透明细胞癌组织中仅有50%的阳性表达率，黏液性肿瘤组织中未见表达，且在肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌等中亦未见表达，HE4 是目前诊断卵巢癌灵敏度最高的肿瘤标志物。Hellstrom等[20]比较了卵巢癌患者及正常人血清中 HE4 蛋白含量，发现大多数卵巢癌患者血清中 HE4 蛋白表达明显增高，提示该基因可能是1个卵巢癌相关基因。Drapkin等[15]还应用 RT-PCR技术研究发现，HE4 在卵巢恶性肿瘤细胞系中呈高表达，细胞培养液中含有分泌型 HE4，这与最近在血循环中发现 HE4的报道相一致，这些结果提示，HE4 具有作为肿瘤标志物的前提条件。本研究结果显示，HE4主要表达于卵巢癌组织上皮细胞的细胞质内出现棕黄色颗粒或团块。HE4在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织中不表达或部分表达，在卵巢癌组织中其表达明显升高(74.5%)，差异有统计学意义。结果提示HE4高表达与卵巢癌密切相关，大量表达的HE4可能通过某种机制，促进了卵巢上皮细胞的恶性转化。

3.3 HE4表达与卵巢癌临床病理因素的关系

有研究表明[21]HE4表达与卵巢癌临床分期及淋巴结转移均存在明显相关性，HE4表达水平随临床分期进展、淋巴结转移而升高。管桂峰等[22]在研究中发现HE4蛋白在卵巢癌组织中的表达与肿瘤分期呈正相关，即晚期卵巢癌患者血清HE4水平高于早期卵巢癌。Havrilesky等[23]研究结果也表明，HE4在卵巢癌不同期别中的敏感性不同，Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ期中的敏感性分别为62.4%～82.7%和74.6%～92.5%。本研究结果显示，早期(Ⅰ/Ⅱ期)卵巢癌组织中HE4表达阳性率(57.1%)明显低于中、晚期(Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌组织(89.5%)。本研究还显示卵巢癌高分化者HE4表达阳性率(65.0%)明显低于中、低分化者(92.6%)，差异具有统计学意义。范玉平等[24]研究显示，HE4 表达水平随临床分期的增高而增高，Ⅰ期与Ⅲ/Ⅳ期比较有显著性差异，与本实验研究结果相一致。可见HE4表达随着卵巢癌的临床分期、细胞分化的升高而升高。本研究结果亦显示，在卵巢癌组织中有淋巴结转移组HE4表达水平(72.4%)明显高于无淋巴结转移组(38.9%)，差异有统计学意义；郭冰沁等[25]研究得出：HE4阳性表达率随着卵巢癌的病理分级增高而显著增高，临床分期愈晚表达率愈高，有腹腔器官及淋巴结转移者明显高于无转移者，与本研究结果一致。Kamei等[26]应用免疫组化和RT-PCR技术，分析了120例接受了手术治疗的乳腺癌患者，发现120例患者中71例患者均表达HE4 mRNA和HE4蛋白，HE4表达与临床病理因素无相关性，但与淋巴结转移密切相关。HE4表达阳性组5年无病生存率明显低于HE4阴性组。数据表明，HE4表达与淋巴结转移有关，可能是乳腺癌复发的一个预测指标。本实验亦得出HE4与卵巢癌的淋巴结转移密切相关。由此我们推测HE4可能通过某种机制参与了卵巢癌的发生、发展、侵袭、转移，由于目前国内外关于HE4作用机制的报道甚少，故具体机制目前还在进一步研究中。另外本研究还显示HE4阳性表达与卵巢癌患者年龄(≤52岁和>52岁)无关，差异无统计学意义。

综上所述，HE4蛋白作为1种新型的肿瘤标志物正引起越来越多研究者的关注，其在肿瘤发生、发展和预后方面的作用不断被发现，但是有关HE4蛋白的作用机制、作用细节及受调节的因素等研究甚少，还有很多功能仍未被发现，HE4与卵巢癌的发生、发展、侵袭、转移的关系尚需要进一步探讨。

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