高危HPV与宫颈癌发生的相关性

张敏鸽综述 刘明晖审校

据世界卫生组织国际癌症研究中心统计，宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率已位居第二位，且近年来有年轻化的趋势。现有的研究显示高危型HPV持续感染是导致宫颈上皮内瘤变，并进一步引发宫颈癌的主要病因。现将高危型HPV在宫颈癌中的致癌机制综述如下。

1 HPV结构与功能

HPV是1种嗜黏膜和皮肤的双链闭合环状DNA病毒，属乳头状病毒科。HPV基因组按功能分为3个编码区：①早期基因区(E区)：分别编码早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7。E区基因编码产物的生物学功能主要涉及病毒基因组的复制、转录调节和诱导宿主细胞发生转化。E1参与病毒复制；E2参与病毒复制与基因转录调节，高危型HPV的E2具有抑制E6、E7基因启动子的作用；E4主要与病毒颗粒的成熟和释放有关，E4能破坏细胞骨架，打乱细胞质角蛋白网络，使挖空细胞形成。此外，E4可能支持病毒基因组的扩增。E5能与多种细胞膜蛋白及生长因子受体结合，刺激病毒基因组复制。最近发现，E5还能阻止DNA损伤后细胞的凋亡。E6、E7主要与细胞转化及致瘤性有关，其致瘤作用与细胞周期调控机制及肿瘤抑制基因密切相关。②晚期基因区(L区)：L1和L2分别编码病毒的主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白，共同构成包装病毒的外壳。③上游调节区：功能不明确，可能对病毒复制及转录起调节作用。

2 HPV在宫颈癌中的致癌机制

现已证实至少有18种高危型HPV能引发宫颈癌，研究表明，在85%～90%的宫颈腺癌中可检测到高危型HPV，而HPV阴性者几乎不发生宫颈癌。在高危型HPV中， HPV16 及18型是世界范围内宫颈癌感染的主要类型，感染率分别为50%和20%[1]，因而，绝大多数研究集中在HPV16及HPV18上。HPV16和HPV18可能通过以下机制参与宫颈癌的发生。

2.1 HPV E6/E7蛋白与宿主染色体整合

高危型HPV16 E6、E7已被证实为转化基因，E7是效能最强的癌基因，其次是E6，且E6能增强E7转化上皮细胞的能力，其编码的E6、E7蛋白与细胞转化和病毒复制的调控有关，并在宫颈癌细胞系和组织内持续表达，因此在宫颈癌细胞系中沉默这2种病毒基因可导致细胞快速死亡。HPV感染宿主细胞后低危型HPV-DNA总是保持游离状态，很少整合到宿主基因组中，而大部分高危型HPV-DNA常整合到宿主细胞DNA中，在宫颈癌中高危HPV的E6和E7癌蛋白整合基因组的复制导致基因组的不稳定，E7蛋白还通过打断G1/S检查点，激活DNA损伤反应，诱导中心体复制错误导致非整倍体细胞形成[2]，说明病毒基因整合到宿主基因后对细胞转化、永生化以及肿瘤的发生起重要作用。

2.2 HPV E2基因

在HPV整合过程中，许多基因被破坏或缺失，其中以E2基因的破坏尤为重要。E2能抑制E6和E7蛋白功能，当HPV发生整合后，E2的开放读码框(ORF)常会遭到破坏，导致E2基因编码的E2蛋白失活及功能丧失，接着引起E6、E7基因过表达，转化能力增强， 导致细胞的转化或癌变。另外，E2蛋白还能通过诱导凋亡途径达到抑制细胞增殖的作用[3]。故认为在正常HPV病毒的生命周期中，E2蛋白主要是起抑制作用。最近研究发现，正常人角蛋白细胞表达正义线粒体非编码RNA (SncmtRNA-1)和反义线粒体非编码RNA (ASncmtRNAs)，而宫颈癌细胞株SiHa 和 HeLa表达SncmtRNA-1及低水平的ASncmtRNAs，用完整基因组的HPV16和18感染的永生化的人角蛋白细胞也表达SncmtRNA-1及低水平的ASncmtRNAs。相对于未转染细胞或用脂质体2000转染的对照细胞，用反义寡核苷酸(ASO-1AS)敲除SiHa 和 HeLa中的SncmtRNA-1，细胞增殖及DNA合成明显受抑制，同时发现低表达的ASncmtRNAs是细胞瘤性转化以及肿瘤进展中关键的一步，推测ASncmtRNAs在肿瘤细胞中的低表达提示其作为线粒体编码的肿瘤抑制因子的潜在可能性。进一步发现，HPV16和18的E2基因在瘤性转化以及肿瘤进展中参与了ASncmtRNAs的降调节[4]。

2.3 HPV E5基因

E5的功能是促进细胞转化，这种功能发生在宫颈癌的早期。在宫颈癌细胞系C-33A，HPV16 E5的表达能抑制过氧化氢介导的细胞凋亡，HPV16 E5降解Bax蛋白的表达，Bax的外源性表达消除了E5的抗凋亡作用，通过siRNA敲除E5则激活宫颈癌细胞系CaSki通过过氧化氢诱导的细胞凋亡，同时也上调Bax蛋白的表达，短暂表达的E5通过泛素化作用明显增加Bax蛋白的降解，环氧化酶2抑制剂、前列腺素E2受体拮抗剂和环磷酸腺苷依赖的PKA抑制剂能抑制E5介导的Bax蛋白降调节。用前列腺素E2能下调Bax蛋白的表达并抑制过氧化氢诱导的C-33A细胞的凋亡，进一步证实HPV16 E5蛋白是通过激发泛素蛋白酶介导的Bax蛋白的降解来抑制过氧化氢诱导的宫颈癌细胞凋亡，COX-2，PGE2和PKA也参与此过程[5]。说明HPV16E5蛋白通过抑制细胞凋亡来促进宫颈癌的发生、发展。

2.4 抑制肿瘤抑制基因p53及Rb

HPV16 E6蛋白能降解多种细胞蛋白，包括肿瘤抑制基因p53和多个PDZ结构域蛋白，研究表明来自于高危型HPV16、18、33、35、39、45、51、52、53、56、58、66、70、82的E6蛋白均能降解p53，体外研究发现这些E6蛋白降解p53的效能是相似的，相反，表达低危型HPV6、11、44、54和61的E6蛋白的角蛋白细胞不发生p53降解。当发生单点变异后的E6F47R则能完全逆转HPV16 E6癌蛋白的作用，在HPV阳性宫颈癌细胞系，E6F47R作为1个显性负性突变体通过阻止内源性E6降解p53而提高p53蛋白水平。然而，E6F47R的持续表达通过早衰抑制宫颈癌细胞株HeLa细胞的增殖，针对p53的siRNA能抵消E6F47R的表达效果[6]。这表明E6F47R是主要通过p53信号途径诱导细胞衰老。

E6、E7基因编码蛋白能分别与抑癌基因p53(针对E6)和Rb蛋白(针对E7)结合，同时抑制p27、p21及p15等细胞周期调节基因，使大量细胞由细胞周期G1期进入S期，使其失去对细胞生长周期的正常调控而引起细胞无限增殖并向恶性转化。进一步研究发现，高危型HPVE6蛋白与野生型p53结合诱导p53快速降解此过程依赖1种细胞蛋白E6相关蛋白(E6-AP)。E6蛋白通过与E6-AP形成复合物可起到泛肽-蛋白激酶的作用降解和失活p53，最近发现HPV16和HPV18的E6蛋白也与其他的泛素连接酶相互作用，在无E6AP蛋白的小鼠上皮细胞中E6加速p53的降解，这意味着其它的遍在蛋白连接酶参与了HPV介导的p53降解[7]，沉默E6蛋白导致p53和p21的增多，相反，沉默E7蛋白导致Rb蛋白的过度磷酸化，相对于HPV阴性的细胞，缺失E6和E7蛋白的HPV阳性细胞则选择性减少细胞生长和细胞大量死亡。HPV16-E7 shRNA通过激活p53、p21和Rb能显著促进HPV16相关的癌细胞的凋亡[8]。抑制HPV E6、E7癌蛋白则肿瘤抑制基因复活、肿瘤细胞凋亡。Withaferin A (WA)是药用植物Withania Somnifera的有效成分，它能降调节HPVE6和E7癌蛋白的表达，导致p53和p21cip1/waf1水平升高及宫颈癌细胞凋亡，使细胞周期停滞于G2/M期，降低STAT3和它的Tyr705 和Ser727磷酸化水平，以及调节p53介导的凋亡基因Bcl-2，Bax，caspase-3和裂解的 PARP[9]。Tan用小干扰RNA (siRNA)抑制E6后使p53表达水平恢复，使HPV16+的宫颈癌细胞株SiHa对顺铂、放射敏感而凋亡，E6 siRNA 导致E6 mRNA水平降低并且提高了p53和p21表达[10]。

在1个正常角蛋白细胞中，Rb-组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)蛋白复合体抑制E2F/DP-1转录复合体的活性，在G1期，E2F-DP1与DNA结合，在S期，Rb被细胞周期蛋白D/CDK4/6激酶磷酸化，导致Rb-HDAC 从 E2F-DP1-DNA复合体释放出来。从E2F-DP1-DNA释放出来的 Rb-HDAC导致E2F诱导的参与DNA合成的基因激活，在1个高危HPV感染的角蛋白细胞中，E7蛋白通过磷酸化Rb和(或)HDAC(组蛋白脱乙酰基酶)蛋白，导致Rb-HDAC 从 E2F-DP1-DNA复合体脱离出来，导致E2F启动子的激活以及细胞周期的进展[11]。

2.5 p16INK4A的过表达

在HPV感染宫颈上皮细胞中，p16INK4A在宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌中过表达，Missaoui等通过回顾性研究发现正常宫颈及宫颈良性病变中不表达p16INK4A，在CINⅠ弱表达，而在CINⅡ、CINⅢ以及宫颈鳞状细胞癌强表达，并发现p16INK4A过表达与宫颈上皮内瘤样病变的级别以及高危HPV感染有关[12]，Tsoumpou等通过Meta分析发现宫颈涂片中过表达p16INK4A的程度与细胞学异常的严重性是一致的。相对于LSIL 45%和HSIL 89%的p16INK4A阳性表达率，正常涂片的p16INK4A阳性表达率仅12%，正常活组织检查p16INK4A的阳性率仅为2%，CINⅠ为38%，CINⅡ68%和CINⅢ为82%[13]。CARMEN发现在宫颈细胞学中，ASC-US中 p16INK4A阳性表达为16.66%，LSILs为40.62%，HSILs为96.29%，SCCs为100%[14]。进一步发现p16通过钝化细胞周期蛋白依赖激酶作用在细胞周期中安置制动蛋白依赖激酶能磷酸化Rb蛋白，在宫颈癌中，通过HPV E7降解PRb的负反馈调节机制导致p16的上调，p16INK4A抑制细胞周期蛋白依赖激酶CDK-4或-6与细胞周期蛋白D结合，这是调节G1细胞周期关卡[15]。

2.6 激活端粒酶

端粒酶是使端粒延伸的反转录DNA聚合酶，正常情况下不表达，但在85%以上的肿瘤细胞中呈阳性表达。因而目前将端粒酶作为肿瘤发生的分子标记之一。端粒酶的激活是高危型HPV感染宫颈上皮后由CIN向癌转化的过程中相当关键的步骤。Bedard等[16]报道HPVE6/E7的转录基因可以诱导端粒酶的活性和永生化，发现在宫颈癌和CIN的鳞状上皮损害早期就有改变，但也在低分化鳞状上皮损害时表达。通过sh/siRNAs沉默E6AP基因，端粒酶的活性降低，证实E6AP参与了E6介导的端粒酶激活。罗琼等[17]发现端粒酶活性随着宫颈病变程度的进展逐渐增高。Xu等[18]发现在90%以上的宫颈癌及近一半的宫颈上皮内瘤样病变中端粒末端转移酶活性增强，而在大多数正常宫颈组织以及低级别宫颈上皮内瘤样病变中没有检测到hTERT mRNA和端粒末端转移酶活性。这说明端粒酶的活性增加与宫颈癌发生的早期阶段有关。

在上皮细胞，NFX1作为2个剪接变体表达。NFX1的2个亚型都参与hTERT的调控。较短的亚型NFX1-91，是核内蛋白。在hTERT启动子部位，NFX1-91通过直接干扰mSin3A 和HDACs(组蛋白脱乙酰基酶)保持转录不活动状态来抑制hTERT的表达。在HPV16 E6存在下，E6AP只能作用于较短的亚型NFX1-91，E6与E6AP能降解hTERT抑制物NFX1-91，通过降解NFX1-91，E6/E6AP改变了hTERT启动子的染色体结构，从而导致hTERT的表达增加。较长的亚型，NFX1-123，存在于蛋白质，在细胞核内不存在，它与细胞质内的多聚腺甘酸结合蛋白质类 (PABPCs)一致地通过增加hTERT mRNA的稳定性来上调hTERT的表达。

2.7 其它致癌机制

HPV16 E6蛋白通过NF-kB途径上调抑制细胞凋亡的蛋白如：c-IAP2和survivin。c-IAP2是NF-kB应答基因，经常作为NF-kB上调的指示剂，降低NFX1-91，则上调c-IAP2。E6/E6AP通过诱导NFX1-91的降解来正调节NFkB信号途径，这包括NFkB应答基因的升调节以及NFkB抑制基因的降调节。E6还能防止肿瘤坏死因子TNF诱导的细胞凋亡。P105，是p50的前体，是NFkB的抑制剂。p105在细胞中广泛表达，它的启动子区包含有NFkB和其它转录因子的结合位点，如E2F、Sp1和 Ets。NFX1-91通过结合到p105的启动子区并且升调节它的转录活性来调控p105的表达，E6/E6AP通过诱导NFX1-91的降解降低p105和它分解产物p50的表达，p50，如p65/c-Rel缺乏，可能影响NFkB异二聚体的结构，这种NFkB复合物抑制HPV基因表达。E6利用多种机制调节NFkB的活性，在缺氧环境下，E6能诱导NFkB抑制剂CYLD的降解去激活NFkB途径，但在含氧正常的情况下，这种现象看不到。表明E6不同条件下利用不同机制调控NFkB的活性[19]。

HPV16 E6癌蛋白抑制角蛋白细胞表面黏附分子E-cadherin。降低HPV感染的角蛋白细胞表面的E-cadherin的表达则在感染上皮中的抗原提呈细胞郎罕氏细胞数量也会减少，因为郎罕氏细胞通过E-钙黏蛋白发生黏附，潜在降低了对HPV的免疫监视作用。AzaDC (1个DNA甲基转移酶抑制剂)和 I3C通过1个p21(Waf1/Cip1)依赖机制对抗E6提高E-cadherin表达，从而恢复了HPV感染表皮中的抗原提呈细胞，因此它能对抗HPV16诱导的免疫逃避机制以恢复感染部位的免疫功能。

最近研究表明，HPV16 E6和E7通过传感器toll-like 受体 (TLRs)家族来调控先天性免疫应答。这些癌蛋白通过不同的机制抑制TLR9的表达，经证实它能识别dsDNA序列，而低危型HPV不具有这种特性。高危型HPV还有一些特性，如非裂解性复制，在免疫组织低蛋白表达，在顶端释放病毒颗粒，这些能减少或防止它们暴露于宿主的防御功能之下[20]。

综上所述，在宫颈癌发生过程中，感染高危HPV后不仅导致抑癌基因、癌基因改变、染色体非整倍性变异、基因缺失或突变以及细胞转化等分子遗传学的改变，还在逃避宿主免疫应答中具有重要作用，这些功能是高危型HPV介导的肿瘤发生的基本机制。

[1] Smith JS,Lindsay L,Hoots B,et al.Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical lesions:a meta-analysis update〔J〕.Int J Cancer,2007,21(3):621.

[2] McLaughlin-Drubin ME,Munger K.The human papillomavirus E7 oncoprotein〔J〕.Virology，2009,384(2):335.

[3] Castellsagué X.Natural history and epidemiology of HPV infection and cervical cancer〔J〕.Gynecologic Oncolog,2008,110(3):S4.

[4] Villota C,Campos A,Vidaurre S,et al.Expression of mitochondrial ncRNAs is modulated by high risk HPV oncogenes〔J〕.J Biol Chem,2012,287(25):21303.

[5] Oh Jung-Min,Kim Su Hyeong,Cho Eun-Ah,et al.Human papillomavirus type 16 E5 protein inhibits hydrogen peroxide-induced apoptosis by stimulating ubiquitin-proteasome- mediated degradation of Bax in human cervical cancer cells〔J〕.Carcinogenesis,2010,31(3):402.

[6] T Ristriani,S Fournane,G Orfanoudakis,et al.Masson.A single-codon mutation converts HPV16 E6 oncoprotein into a potential tumor suppressor,which induces p53-dependent senescence of HPV-positive HeLa cervical cancer cells〔J〕.Oncogene,2009,28(5):762.

[7] P Massimi,A Shai,P Lambert,et al.HPV E6 degradation of p53 and PDZ containing substrates in an E6AP null background〔J〕.Oncogene,2008,27(12)：1800.

[8] Ni Sima,Wei Wang,Debo Kong,et al.RNA interference against HPV16 E7 oncogene leads to viral E6 and E7 suppression in cervical cancer cells and apoptosis via upregulation of Rb and p53〔J〕.Apoptosis,2008,13(2):273.

[9] Radha M,Hina K,Charu M,et al.Withaferin A induces p53-dependent apoptosis by repression of HPV oncogenes and upregulation of tumor suppressor proteins in human cervical cancer cells〔J〕.Carcinogenesis,2011,32(11):1697.

[10] Tan S,Hougardy BM,Meersma GJ,et al.Human papilloma virus 16 e6 RNA interference enhances Cisplatin and death receptor-mediated apoptosis in human cervical carcinoma cells〔J〕.Mol Pharmacol,2012,81(5):701.

[11] Chauhan SC,Jaggi M,Bell MC,et al.Epidemiology of Human Papilloma Virus (HPV) in Cervical Mucosa〔J〕.Methods Mol Biol,2009,471(111):439.

[12] Missaoui N,Hmissa S,Sankaranarayanan R,et al.p16INK4A overexpression is a useful marker for uterine cervix lesions〔J〕.Ann Biol Clin,2010,68(4):409.

[13] Tsoumpou I,Arbyn M,Kyrgiou M,et al.p16INK4a immunostaining in cytolo-gical and histological specimens from the uterine cervix：a systematic review and meta-analysis 〔J〕.Cancer Treat Rev,2009,35(3):210.

[14] Ungureanu C,Socolov D,Anton G,et al.Immunocytochemical expression of p16INK4a and HPV L1 capsid proteins as predictive markers of the cervical lesions progression risk〔J〕.Romanian Journal of Morphology and Embryology,2010,51(3):497.

[15] Krakowczyk L,Strzelczyk JK,Adamek B,et al.Methylation of the MGMT and p16 genes in sporadic colorectal carcinoma and corresponding normal colonic mucosa〔J〕.Med Sci Monit,2008,14(10)：219.

[16] KM Bedard,MP Underbrink,HL Howie,et al.The E6 oncoproteins from human betapapillomaviruses differentially activate telomerase through an E6AP-dependent mechanism and prolong the lifespan of primary keratinocytes〔J〕.Virol,2008,82(8):3894.

[17] 罗 琼,熊树华,徐国荣,等.端粒酶在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达及意义〔J〕.实用癌症杂志,2009,24(3):242.

[18] Xu M,Luo W,Elzi DJ,Grandori C,et al.NFX1 interacts with mSin-3A/histone deacetylase to repress hTERT transcription in keratinocytes〔J〕.Mol Cell Biol,2008,28(15):4819.

[19] Xu M,Katzenellenbogen RA,Grandori C,et al.NFX1 Plays a Role in Human Papillomavirus Type 16 E6 Activation of NFkB Activity〔J〕.Journal of wirology,2010,84(21):11461.

[20] UA Hasan,E Bates,F Takeshita,et al.TLR9 expression and function is abolished by the cervical cancer-associated human papillomavirus type 16〔J〕.Immunol,2007,178(5):3186.