协同刺激分子B7-H4 在卵巢癌中的研究进展

徐 梅综述 吴昌平 蒋敬庭审校

卵巢癌位于盆腔，由于缺乏早期临床症状及有效的诊断方法，大约70%的患者就诊时已属于晚期，其5年存活率不足30%[1,2]，若能早期诊断，其5年存活率将增加至80%[2]。

B7-H4是B7家族的1个新成员，能通过抑制细胞的增殖、阻碍细胞因子的产生和细胞周期的进程负性调控T细胞免疫应答[3～5]。大量的研究发现B7-H4分子在许多恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的发生、发展和预后相关[3,4,6～11]。B7-H4在卵巢癌组织中的过表达使之有望成为新的肿瘤标志物，作为卵巢癌早期诊断指标及免疫治疗新靶点[12～16]。

1 B7-H4

1.1 B7-H4分子的结构与生物学功能

机体抗肿瘤免疫功能主要由T细胞免疫介导，而T细胞的活化需要双重信号的诱导，即MHC-TCR抗原提呈信号和协同刺激信号。已发现的协同刺激分子包括B7/CD28超家族、TNF/TNFR超家族、CD2超家族以及部分整合素，相互之间具有完全不同或部分重叠的生物学功能[17]。B7/CD28家族是重要的协同刺激分子，已被鉴定的B7家族成员有B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-DC(PD-L2、CD273)、B7-H1(PD-L1、CD274)、B7-H2(ICOSL、CD275)、B7-H3(CD276)、B7-H4(又称 B7S1 和 B7x，[4,18～20]、B7S3[21]和 B7-H6[22]。它们不仅提供了在启动、增强和维持T细胞应答中关键性的正性信号，而且还可提供重要的负性信号来限制、终止或消弱T细胞的免疫应答[4,23,24]。

B7-H4又称B7S1和B7x，是2003年研究[20,25,26]确定属于B7家族的1个新成员。研究[27]发现人B7-H4的基因定位于人染色体1p11.1，跨度为66 kb，其中外显子6的功能是选择性剪接，可调节生成2种不同的转录物。而且在人染色体20p11.1存在1个B7-H4假基因，在编码区仅含有1个外显子和2个终止密码子，与编码B7-H4的cDNA在核酸水平的相似性高达94%。小鼠的B7-H4分子定位于小鼠3号染色体上，有6个编码区,在蛋白结构上与人B7-H4同源性高达87%。

2005年，Salceda等[13]首次在卵巢癌及乳腺癌cDNA中鉴定出DD-O110基因，并发现DD-O110 cDNA编码1个Ⅰ型跨膜糖蛋白，经鉴定DD-O110即B7-H4。这个基因编码含有282个氨基酸的信号序列，包括1个信号序列、1个免疫球蛋白功能区和1个-COOH末端疏水性跨膜区[14,20]。研究者认为B7-H4分子是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上[20]。Carreno和Watanabe等[18,28]推测B7-H4受体为B和T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)。该受体为胞内尾段具有2个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs ITIM)的免疫球蛋白。它在初始T细胞(naive T cell,Tn)及效应性Th2细胞不表达，而表达于效应性Th1细胞上，该分子与抗原受体交联能使其胞内区的ITIM中的酪氨酸残基磷酸化启动酶促级联反应，进而下调T细胞增殖反应，抑制细胞因子IL-2的分泌，认为BTLA是类似CTLA-4 和PD-1的抑制性受体。

1.2 B7-H4分子在体内的表达和分布

B7-H4 mRNA表达于专职抗原递呈细胞(antigen-presenting cells ，APC)，广泛分布于人的正常外周非淋巴组织如肺、小肠、胎盘、肝、骨骼肌、肾、胰腺、前列腺、卵巢等[20,25,27]，然而对人B7-H4特异性单克隆抗体进行免疫组化，结果显示正常来源的上述组织均阴性表达，而B7-H4可表达于人类一些恶性肿瘤组织。研究表明正常外周组织能在转录水平对B7-H4的表达进行严密地调控[20,24,26,27]。一些学者[14,29]认为B7-H4定位于肿瘤细胞膜，而Salceda等[13]实验显示B7-H4不仅表达于肿瘤细胞的胞膜而且表达于胞质，Kryczek等[30]则认为其定位于卵巢癌细胞内，而在肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)仅定位于包膜。在肿瘤患者的血浆[6,14,29,31]及腹腔积液[14]中亦可检测到较高水平可溶性B7-H4(sB7-H4)。流式细胞术(fluorescence activated cell sorter，FACS)分析显示，新鲜分离的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞表面无B7-H4分子表达，但在体外能被IL-6和IL-10诱导表达[20,25,27]。

1.3 B7-H4分子的作用机制

大量研究表明，B7-H4具有负性调控T细胞的免疫应答作用，通过抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖、抑制细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的产生，阻断细胞周期使T细胞停滞在G0/G1期[13,20,25～27]。B7-H4的高表达可以保护表皮细胞免于失巢凋亡，促进上皮细胞的恶性转化[13]，并能通过抑制嗜中性粒细胞的产生而调节固有免疫[4,32]。研究表明B7-H4分子是T细胞1个强有力的减弱因子，在下调组织特异性免疫和肿瘤免疫逃逸机制中发挥重要作用。

CD4+CD25+调节性T(regulatory T,Treg)细胞是1种免疫抑制性细胞，占CD4+T细胞的5%～10%。Kryczek等[33]发现Treg细胞能刺激APC分泌IL-6和IL-10，在IL-6和IL-10的作用下APC表达B7-H4，进而发挥免疫抑制效应。事先阻断B7-H4可下调Treg对APCs介导的免疫抑制活性。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4则可以抑制APC表达B7-H4。然而，IL-6、IL-10、GM-CSF、IL-4不能对肿瘤细胞中B7-H4 mRNA和蛋白的表达进行调控，表明肿瘤细胞表达B7-H4的调控机制和APC有所不同。他们[30]还发现抑制肿瘤相关抗原特异性T细胞效应的是B7-H4阳性TAM，而不是B7-H4阳性卵巢癌细胞。Kryczek等[34]进一步研究发现B7-H4阳性TAM的数量与Treg细胞的数量呈显著正相关，并且卵巢癌患者的预后与Treg细胞和B7-H4阳性TAM的数量呈负相关，而与B7-H4阳性卵巢癌细胞表达量无关。而Chen等[29]通过体内实验发现肺癌细胞膜B7-H4的表达随着肿瘤的进展而增加，若增加TAM可显著增强这种效应，而B7-H4 mAb可明显抑制肿瘤的生长。体外实验发现B7-H4阳性肺癌细胞可明显抑制T细胞增殖效应，认为是TAM诱导肺癌细胞B7-H4表达，进而通过抑制T细胞增殖效应而促进肿瘤的生长。

目前对B7-H4分子介导的信号通路尚不清楚。Wang等[35]用B7-H4 Ig融合蛋白作用于CD3+表达B7-H4的鼠T细胞，可抑制TCR/CD28信号转导，包括MAP激酶，ERK，p38及JNK的磷酸化。同时也包括AKT激酶的磷酸化，通过内生性GSK-3的磷酸化削弱其酶的活性。相反，TCR相邻的酪氨酸激酶ZAP70和淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK)的磷酸化状态并没有因此而改变。因此推测B7-H4是通过干扰ERK、JNK和AKT的激活，而不是通过干扰ZAP70或LCK的激活来抑制T细胞增殖和IL-2分泌。

2 B7-H4分子在卵巢癌中的表达及临床意义

CA125是上皮源性卵巢癌传统的血清学及组织学标志物，对早期卵巢癌诊断的敏感性为27%～66%[36]。在良性卵巢肿瘤、盆腔炎症、肠癌、输卵管腺癌、子宫内膜癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等疾病中CA125也会升高[2,31]，故其不能作为卵巢癌诊断的金指标。因而寻找1种特异性强、灵敏性高的生物指标或联合几种标志物的检测对卵巢癌早期诊断与治疗具有极为重要的意义。

Salceda等[13]用定量多聚酶链反应(QPCR)分析13例不同病理类型的卵巢癌和13例正常卵巢组织，结果显示，B7-H4 mRNA在87.5%的卵巢浆液性乳头状腺癌组织中高表达，比正常卵巢组织中B7-H4 mRNA的平均水平高出至少2倍。而另外5例黏液性卵巢癌和交界性卵巢癌组织中B7-H4 mRNA的表达水平与正常卵巢组织相当，因此认为B7-H4 mRNA在卵巢癌中的表达具有组织特异性并定位于包膜。Tringler等[16]研究发现B7-H4在所有原发卵巢浆液性癌(32例)、内膜样癌(12例)、透明细胞癌(15例)、所有转移浆液性癌(23例)和转移性内膜样癌(7例)中100%表达，但在11例黏液性癌中仅1例表达。

Simon等[14]利用敏感的双克隆ELASA夹心法研究2500余例卵巢癌患者的血清、腹腔积液及肿瘤组织溶解物中B7-H4的表达情况，结果显示，B7-H4蛋白在卵巢癌组织溶解物中高表达。血清标本中均可检测出低浓度的B7-H4蛋白，但与健康人和良性卵巢肿瘤相比，卵巢癌患者的血清标本中B7-H4的表达显著升高，特别是子宫内膜样癌、浆液性癌高于黏液性癌。他们[37]还通过检测B7-H4和CA125在251例卵巢癌患者卵巢组织溶解物中的表达情况，发现B7-H4在卵巢癌Ⅰ期患者中有48%、Ⅱ期患者有55%过表达，而晚期患者表达高达67%，B7-H4表达水平越高患者预后越差。与之相比，CA125在早期患者仅31%升高。而且，在30例没有CA125表达的早期卵巢癌中却有B7-H4的表达。B7-H4联合CA125检测诊断早期卵巢癌阳性率可增至65%。Simon等[31]进一步分析68例卵巢癌(16例早期，52例晚期)、108例正常对照组和20例健康妇女血清标本中CA125、B7-H4、Spondin2、DcR3的表达水平，结果显示B7-H4特异性最高，CA125次之。

骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是1种具有多种功能的分泌性磷酸化糖蛋白，可促进细胞的黏附和迁移，被认为是恶性转化的分泌性蛋白，其过度表达与肿瘤细胞生长、增殖和侵袭、转移密切相关。Zhang等[8]采用免疫组化法检测15例正常卵巢组织、20例卵巢良性肿瘤组织、20例卵巢交界性肿瘤组织、40例卵巢癌组织标本中OPN和B7-H4的表达情况，结果显示：OPN和B7-H4在上皮性卵巢癌组织中的表达高于卵巢交界性及良性、正常卵巢组织；OPN和B7-H4在低分化卵巢癌中的阳性率均显著高于高、中分化卵巢癌，Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌中的阳性率亦显著高于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌；B7-H4在卵巢浆液性癌中的阳性率显著高于黏液性癌；显示B7-H4在卵巢癌中表达具有组织特异性。因此认为，B7-H4分子可作为卵巢癌特别是浆液性卵巢癌新的生物学指标，可作为早期卵巢癌的1个重要诊断标志物，是CA125检测早期卵巢癌的很好补充。

综上所述，B7-H4分子是最近发现的T细胞共刺激分子B7家族的新成员，其在发病率高且预后差的浆液性卵巢癌中高表达，预示B7-H4会是1个具有极大应用前景的新的肿瘤标志物，联合检测有助于卵巢癌的早期诊断。以B7-H4为靶点抑制B7-H4阳性的TAM活性将会是卵巢癌免疫治疗中增强T细胞免疫的1个新策略。但是B7-H4蛋白的信号调节通路及其受体目前还不确定，深入研究其确切的作用机制，可为卵巢癌的诊治提供新的策略。

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