循环核酸在癌症中的研究进展

范洪君综述 刘风玲审校

循环核酸是指存在于血浆或血清等体液中的细胞外游离状态的核酸。早在1948年，Mandel与Métais[1]首次发现了人类血液中循环核酸的存在，但当时并未引起学术界太大的关注。直到1994年，肿瘤患者血液中RAS基因片段的检测及应用[2]，医学界才重新认识到循环核酸的重要性。鉴于循环核酸在肿瘤无创诊断及连续检测等方面的优势，它正逐渐成为国内外肿瘤学界研究的热点。

1 循环核酸的组成及发现

1.1 循环DNA

1966年，Tan等[3]在系统性红斑狼疮患者体内发现了高水平的游离循环DNA，之后在风湿性关节炎、肾小球肾炎、肝炎和癌症等患者体内也检测到了高水平的循环DNA。1989年Stroun等[4]从多种癌症患者血浆中抽提纯化DNA,发现肿瘤负荷较大的晚期恶性肿瘤患者体内可检测到循环DNA，并首次揭示了循环DNA可能具有肿瘤DNA的某些特征。1994年，癌症患者血浆DNA中检测出N- ras等癌基因突变[2]。1996年，Chen[5]和Nawroz[6]同时报道了肿瘤患者血液中存在微卫星改变,且同肿瘤原发灶中微卫星改变一致。从此，循环DNA的研究进入了崭新的阶段。

目前研究认为，循环DNA主要来自肿瘤微环境中癌细胞的凋亡、坏死及肿瘤组织的分泌，坏死及凋亡的肿瘤细胞通常被巨噬细胞所吞噬，并将消化后的核酸释放到肿瘤组织环境中去[7]。此外，血液中的循环肿瘤细胞以及骨髓、肝脏等转移灶也是循环DNA的来源[8,9]。在其检测方面，荧光染色法及定量聚合酶链式反应(如SYBR Green和TaqMan探针)等多种方法可对循环DNA进行测定。

1.2 循环mRNA

1979年，Hamilton等[10]在健康人和多发性骨髓瘤患者血浆中分离到循环RNA分子，第1次较准确地定量了血浆RNA水平。然而，血液中含有丰富的RNA酶且RNA分子极不稳定，因此循环RNA理论一开始并未得到学术界的广泛认可。直到1999年，Kopreski等[11]在恶性黑色素瘤患者血浆中检测到肿瘤细胞来源的mRNA分子才开创了循环mRNA用于肿瘤分子诊断领域。

目前对循环mRNA来源的研究认为，mRNA可以与蛋白质及脂类等结合而不被降解，最终由细胞表面脱落入血[12,13]。微列阵技术和逆转录实时定量PCR技术常用于其检测。

1.3 循环miRNA

miRNA是一类长度为19～25个核苷酸的非编码小RNA，能在转录后或者在翻译水平上影响基因表达。大约50%的miRNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragile site)，这说明miRNA可能在肿瘤发生过程中起至关重要的作用。miRNA具有调控细胞周期、分化细胞等基本功能，参与机体的生长发育及疾病的发生与发展。此外，miRNA在造血细胞分化发育、免疫细胞功能和肿瘤发生方面发挥着重要的作用。

1993年，Lee等[14]在线虫中首次发现了小分子非编码RNA：Lin4。2000年，Reinhart等[15]又发现了具有转录后调节功能的小分子RNA：Let-7。2008年，来自牛津大学的Lawrie等[16]在慢性大B细胞淋巴瘤患者血清中检测到了miR-21，并发现miR-21与患者无复发生存率相关，从而开创性的将循环miRNA引入肿瘤领域。

循环miRNA是通过神经酰胺依赖的分泌机制，从细胞中释放，并包埋在脂质或脂蛋白复合物，如凋亡小体、微泡及外切体中[17,18]。由于miRNA体积极小并与脂质及蛋白质附着，高效率及可重复抽提仍然是目前研究的主要困难。目前，实时荧光定量PCR技术仍是定量检测循环miRNA的主要方法。

2 循环核酸的应用及研究热点

检测患者血液中循环核酸以避免肿瘤组织活检，这将在肿瘤无创诊断领域有着广阔的应用前景。定期复查患者血液中循环核酸，为及时发现患者病情进展与疗效评价提供了1种崭新的手段。目前，对循环DNA领域的研究主要集中在微卫星不稳定、杂合性缺失、癌基因突变、基因多态性及甲基化方面；循环mRNA领域则集中在酪氨酸酶mRNA、端粒酶成分及不同肿瘤相关基因编码的mRNA；而循环miRNA领域集中在发现癌组织中特异表达的miRNAs及找出肿瘤各期差异的miRNAs，从而完成对肿瘤的诊断和分期。

3 循环核酸与癌症

3.1 乳腺癌

Sharma等[19]对100例乳腺癌患者肿瘤组织中和血清中BRCA1、MGMT及GSTP1启动子甲基化检测，证实了血清中DNA甲基化检测可代替肿瘤组织检测，血清中DNA甲基化可作为乳腺癌诊断及预后预测的标志物。Heneghan等[20]通过实时定量PCR法对163例癌症患者(包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌及恶性黑色素瘤)和63例健康人的血液进行检测，证实循环miR-195对乳腺癌诊断的敏感度和特异度分别为88%和91%，联合循环let-7a、miR-10b对乳腺癌诊断的有效率增至94%。因此，循环核酸可作为乳腺癌的诊断标志物。

Wang等[21]研究发现乳腺癌患者血清中miR-21、miR-106a与miR-155表达升高，而miR-126、miR-199a与miR-335表达下调，进一步分析显示miR-21、miR-126、miR-155、miR-199a及miR-335与肿瘤分期及雌孕激素受体表达相关。Heneghan等[22]研究还发现乳腺癌术后患者血液中循环miR-195和let-7a显著下降，并且两者与患者淋巴结转移及ER表达相关。以上研究结果提示，循环核酸不仅与乳腺癌分期相关，还与激素受体表达情况关联。

来自丹麦Sorensen等[23]的研究证实在接受化疗联合赫赛汀治疗的乳腺癌患者中，治疗后血浆HER-2 DNA显著下降的患者对赫赛汀有更高的反应率，并且总生存期显著延长。贾海明等[24]研究显示MAGE-A1和MAGE-A3基因mRNA可以作为特异性肿瘤标志物用于检测乳腺癌患者外周血单核细胞中的乳腺癌细胞，其检测结果可能有助于判断乳腺癌患者的预后。以上研究表明，循环核酸可用于乳腺癌预后预测。

3.2 肺癌

在肺癌的诊断及鉴别诊断方面，Zheng等[25]对74例肺癌患者和68例健康者的血浆进行检测，结果显示，血浆中循环miR-155、miR-197和miR-182在肺癌患者组显著高于对照组，这3种标志物联合诊断肺癌的敏感度和特异度分别为81.33%和86.76%，并且miR-155和miR-197在化疗有效组治疗后显著下降。Shen等[26]联合血液中循环miR-21、miR-210和miR-486-5p对孤立性肺结节良恶性进行鉴别诊断，结果显示三者联合诊断肺癌的ROC曲线下面积达0.86，诊断肺癌的敏感度和特异度分别为75.00%和84.95%。以上研究显示，循环核酸可用于肺癌的诊断与鉴别诊断。

3.3 消化道肿瘤

周俭等[27]利用microRNA芯片和定量RT-PCR法对934个参试者(包括457个乙型肝炎病毒相关性肝癌患者，167个健康志愿者，169个慢性病毒性乙型肝炎患者以及141个肝硬化患者)血浆microRNA进行检测，最后利用7个microRNA组合-miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801诊断肝癌的ROC曲线下面积达0.888，诊断的敏感度和特异度分别为81.8%和83.5%，并且能够有效区分肝癌患者与正常人群、慢性病毒性乙型肝炎患者及肝硬化患者。这为肝癌的早期诊断提供了更加经济与简便的检测手段。

Arigami等[28]证实B7-H3 mRNA在胃癌患者血液中的表达显著高于健康人，B7-H3表达情况与总生存相关，多因素分析显示B7-H3 mRNA是胃癌预后独立预测因子。Liu等[29]通过Solexa测序法检测患者血清中miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34和miR-423-5p，其联合诊断胃癌的ROC曲线下面积达0.897，显著优于胃癌传统肿瘤标志物CEA和CA19-9，并且患者血清中此5种miRNA水平与胃癌分期相关，因此，联合少数循环miRNA是较为理想的肿瘤诊断指标。Cheng等[30]的研究证实在晚期转移性结直肠癌患者血浆中miR-141是除CEA外的又一预测标志物，而且血浆中miR-141含量越高患者预后越差。

Komatsu[31]检测了50例食管鳞癌患者和20例正常人血浆循环原癌miRNAs(miR-21)和抑癌miRNAs(miR-375)，结果表明，食管鳞癌中miR-21并未显著上升而miR-375则显著下降；将二者联合分析，发现miR-21/miR-375的比率显著升高，其ROC曲线下面积为0.816，诊断食管癌的灵敏度和特异度分别为88%和70%。此外，Morimura等[32]还证实了循环miR-18a在胰腺癌诊断中的价值。以上研究均显示了循环核酸在消化道肿瘤早期诊断、预后预测等方面的应用价值。

3.4 泌尿生殖系统肿瘤

Redova等[33]对15例肾细胞癌患者和12例健康人血清进行检测，结果发现肾细胞癌患者循环miR-378和miR-451分别显著升高和下调，二者联合诊断肾细胞癌的灵敏度和特异度分别为81%和83%。Zhang等[34]对109例宫颈癌患者、138例宫颈上皮内瘤样病变及80例健康人血液循环Bmi-1 mRNA进行检测，结果显示，循环Bmi-1 mRNA较宫颈癌传统肿瘤标志物SCC-Ag和CA125有更高的准确性；此外，循环Bmi-1 mRNA较高的患者无病生存期及总生存期显著缩短。

3.5 其他肿瘤

Milas等[35]对分化型甲状腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)的研究发现，术前96%的DTC患者血液中血清促甲状腺素受体(TSHR)mRNA >1 ng/μg，而在良性甲状腺疾病及健康人中却检测不到；术后长期随访证实血液中检测不到TSHR mRNA的DTC患者支持肿瘤尚未复发。Shinozaki等[36]在不同分期的恶性黑色素瘤患者中检测到血清循环DNA存在BRAF V600E突变，且突变率与分期相关，该方法还可以用来监测正在接受治疗的转移性恶性黑色素瘤患者的治疗疗效。2011年8月，美国FDA批准了vemurafenib用于V600E BRAF突变的晚期黑色素瘤患者，这也使得循环DNA中BRAF基因突变检测越来越受到关注。

总之，目前肿瘤患者的治疗依然依赖于早期诊断、合理分期及监测病情变化。肿瘤患者组织活检与血液标志物检测是肿瘤诊断的金标准，但多数情况下这些评估手段仅应用一次。新近研究还证实肿瘤原发灶与转移灶在基因、遗传学及转录水平存在差异，因此对于那些组织活检取材不太容易的患者，循环核酸不仅可以重复取材而且可以监测患者病情的变化，将来可能取代肿瘤组织活检及肿瘤蛋白标志物检测。

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