脑心通对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡的影响

郭合伏

河南省濮阳市中原油田第三社区第二医院，河南濮阳 457321

脑心通对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡的影响

郭合伏

河南省濮阳市中原油田第三社区第二医院，河南濮阳 457321

目的 探讨脑心通对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡的保护作用。方法 应用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型。将大鼠分为假手术组、模型组、低剂量组和高剂量组，各组分别于术前3d和术后给予不同剂量药物灌胃，术后24、48、72、96 h,取脑组织进行HE染色、TTC染色、测定Caspase-3表达的动态变化。结果 脑心通低、高剂量组均能减少大鼠脑梗死体积 （P<0.05），减少Caspase-3阳性细胞表达。结论 脑心通胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡有保护作用。

脑心通；脑缺血再灌注损伤；Caspase-3

缺血再灌注损伤是脑梗死发生后重要的病理生理过程，如何减轻缺血再灌注损伤是目前研究的热点之一。临床研究表明，脑心通治疗气虚血瘀，脉络闭阻所致脑卒中临床疗效确切[1]。但其对急性脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡保护作用的研究尚未见报道。该实验拟采用大鼠脑缺血再灌注模型，应用脑心通干预模型大鼠，探讨其治疗缺血性脑血管病的可能机制。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级健康SD大鼠，雌雄不拘，鼠龄3～4个月，体重250～300 g。由河南省实验动物中心提供。

1.2 药物和试剂

脑心通胶囊粉由陕西咸阳步长制药有限公司提供 （批号：20050619），1 g粉含饮片1 g，临用时以蒸馏水制成需要浓度的混悬液；红四氮唑（TTC）为北京化学试剂公司产品；Caspase-3－抗：兔抗鼠单克隆抗体，DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 实验方法

2.1 造模及神经功能行为学评分

模型的制备参照Zea Longa[2]线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型。

2.2 分组与取材

造模成功的实验动物120只随机平均分为4组，即假手术组、模型组、低剂量组（100 mg/kg）和高剂量组(400 mg/kg)。每组按24、48、72、96 h分为不同的时间点，每时间点6只。动物先连续灌胃3 d，每天2次，第4天造模。术后继续灌胃直至相应的时间点断头取脑。假手术组和模型组依同样的方法给予生理盐水灌胃，直至断头取脑。脑组织固定后石蜡包埋，切片待用。另取12只相应分成4组，每组3只，均在造模24 h后断头取脑做TTC染色。

2.3 脑梗死体积的测定

大鼠在脑缺血再灌注后24 h断头取脑，2%TTC染色，数码照相摄影，计算机图像分析系统分析梗死体积。

2.4 免疫组化染色

Caspase-3免疫组化染色采用SABC法。相邻切片行常规HE染色，光镜观察组织学变化情况。

2.5 结果判定

脑片TTC染色后可见正常脑组织为玫瑰红色，缺血梗死区为苍白色。免疫阳性细胞被染成棕黄色，Caspase-3阳性细胞为胞浆染色，少数胞核也染色。

记数方法：每个大鼠随机任选2张切片，任选脑缺血半暗带区5个视野进行摄像分析，测量每个视野单位面积内阳性细胞数，再记算该切片平均阳性细胞数。

2.6 统计分析

应用SPSS 10.0统计软件包进行数据处理分析。

3 实验结果

3.1 脑心通对脑缺血再灌注大鼠的病理改变的影响

HE染色假手术组未见梗死灶，神经元形态结构正常；模型组镜下见缺血中心区无神经元，仅见少量胶质细胞，细胞间质空泡样改变。低剂量脑心通组与高剂量脑心通组镜下见缺血中心区变小，边缘区神经元变性、坏死减少，多数存活细胞形态相对正常。

3.2 脑心通对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响

与模型组大鼠相比较，低剂量组和高剂量组在缺血2 h再灌注24 h均明显减少大鼠的脑梗死体积，结果见表1。

表1 脑心通对缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响（±s）

表1 脑心通对缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响（±s）

注：与模型对照组相比*P<0.05，**P<0.01。

分组 脑梗死体积占同侧半球体积的百分比（%）假手术组 模型组 低剂量脑心通组 高剂量脑心通组再灌注24h 0±0**16.52±3.6110.27±4.36* 7.65±2.63*

3.3 脑心通对脑缺血再灌注大鼠Caspase-3蛋白表达的影响

与模型组相比，高、低剂量组除0h外，Caspase-3阳性细胞表达减少，结果见表2。

4 讨论

Caspase-3是细胞凋亡程序中关键的同源半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中属中心地位。最近研究报道，Caspase家族在细胞凋亡中具有中心效应，Caspase-3处于表面死亡受体被激活或细胞内死亡信号存在的情况下，始动的Caspase-3活化并引发下游效应，Caspase蛋白水解激活的级联反应，使一系列骨架蛋白及细胞修复酶等靶蛋白裂解导致细胞凋亡，Caspase-3的表达表明细胞必定死亡。因此Caspase-3被称为死亡蛋白酶，是哺乳动物凋亡的关键酶。

脑心通由黄芪、丹参、当归等16味中药组成，具有益气活血、化瘀通络、醒脑开窍、宣痹止痛之功效，临床用于治疗脑梗死、冠心病、血管性痴呆等取得了较好的疗效。用药后患者神经功能改善明显，生活质量提高，血液流变学有明显改变，为临床防治脑卒中的有效药物[3]。

结果表明高、低剂量的脑心通均能明显减轻脑缺血再灌注大鼠脑缺血区神经细胞损伤，减轻病变区神经细胞凋亡，且神经细胞凋亡与Caspase-3的表达呈正相关，提示脑心通减少大鼠缺血半暗带区神经细胞的凋亡和减少Caspase-3的表达有关。

表2 脑心通对脑缺血再灌注大鼠Caspase-3蛋白表达的影响（±s）

表2 脑心通对脑缺血再灌注大鼠Caspase-3蛋白表达的影响（±s）

注：与模型对照组相比*P<0.05，**P<0.01。

分组假手术组模型组低剂量脑心通组高剂量脑心通组剂量生理盐水4 mL生理盐水4 mL 100 mg/kg 400 mg/kg再灌注0 h 2.15±0.55 2.42±1.23 3.14±0.96 2.54±1.33再灌注24 h 2.17±0.75**17.60±6.09 11.32±4.63*7.46±5.56*再灌注48 h 2.54±1.13**16.58±5.69 11.33±5.32*6.74±4.36*再灌注72 h 再灌注96 h 3.22±0.56**13.67±4.90 8.69±5.46*4.38±3.96*2.46±1.13**7.69±2.13 4.97±3.21*2.76±1.89*

[1]王华卿，刘林强，孙海业.步长脑心通治疗缺血性脑血管病疗效观察[J].现代中西医结合杂志，2001（8）：720.

[2]Zea longa E,Weinstein PR,Canson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlussion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)：84-91.

[3]方正龙，袁灿兴，颜乾麟，等.步长脑心通胶囊治疗脑卒中的临床研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2003，1（1）：32-34.

Naoxintong on neuronal apoptosis opter cerebral ischemia

GUO Hefu
Secord Hospital of zhong yuan oilfieid,Puyan city,Hennan Province,the third communty,Henan 457321,China

ObjectiveTo investigate the protective effects of Naoxintong Capsules(NCs)against the cerebral damage in the rat experienced cerebral reperfusion.MethodsThe rat model ofcerebral reperfusion with thread embolism was made.RatsultsRandomly divided into four groups:sham operation group,model group,low does treatment group and high does treatment group.Each group was given difference does medicine three days before the operation and after the operation.At the time of 24h、48h、72h and 96h after opration,the cerebral infarct size， the expression of Caspase-3 were observed,HE staining,TTC staining and Immunohistochemistry technique.Results NCs low does and high does all could reduce the cerebral infarct size(P<0.05);reduce the expression of Caspase-3(P<0.05)in the rats.ConclusionThe results suggest that NCs posses protective effects against the cerebral damage caused by cerebral reperfusion.

Naoxintong;Model of reperfusion;Caspase-3

R285

A

1674-0742（2012）07（c）－0027-02

2012-06-09）