抗真菌药敏试验在2种不同琼脂平板的比较

刘龙燕，袁水斌，邹学森，王春阳,王占科

(1、江西省肿瘤医院检验科,江西 南昌 330029；2、解放军第九四医院检验科，江西 南昌 330000)

抗真菌药敏试验在2种不同琼脂平板的比较

刘龙燕1，袁水斌1，邹学森1，王春阳1,王占科2

(1、江西省肿瘤医院检验科,江西 南昌 330029；2、解放军第九四医院检验科，江西 南昌 330000)

念珠菌；培养基；药敏试验

随着真菌感染发病率的不断上升，真菌感染性疾病的治疗也面临着严峻的挑战，且有关耐药菌株的报道也逐渐增多。肿瘤病人因自身免疫功能低下,受各种医源性因素影响较多,更易发生院内感染[1],特别是深部真菌感染。真菌体外药敏试验也越来越显得重要，这也是临床上用以评价药物敏感性最基本的方法之一。

目前认为准确性、重复性最好的抗真菌药物敏感性试验方法是美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推出的酵母菌的液体培养基稀释法抗真菌药物敏感试验标准方法(M-27)[2]，但该方法操作复杂，难以作为临床常规检查项目。CLSI发表的“酵母菌纸片扩散法抗真菌药敏试验方案”(M44-A)，操作方法简单，结果直观[3]，而且有商品化的抗真菌药敏纸片供应，有利于作为临床常规项目检测。由于目前国内外对酵母样真菌体外药敏纸片扩散法选用培养基配方不是完全一致。因此，对其测试结果可信度受到一定的影响。我们选用5种温州康泰生物科技有限公司的BIO-KONT抗真菌药敏纸片，在真菌药敏专用琼脂(温州康泰生物有限公司)和葡萄糖亚甲蓝改良琼脂(M-H琼脂)2种培养基上，对临床分离的193株常见酵母菌做了检测，以康泰公司的产品为参照，得到了较为满意的比较结果。现将比较分析果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 2010年3月至2010年5月期间从临床送检的确诊真菌感染的标本193株，包括痰、咽拭子、分泌物及尿液等。193株常见临床各种标本分离的致病酵母菌，并经念珠菌显色培养基(科玛嘉)和酵母样真菌糖同化试验生化管鉴定至种；其中白念珠菌162株,热带念珠菌20株，葡萄牙念珠菌1株，近平滑念珠菌7株，季也蒙念珠菌2株，曲霉菌1株。

1.2 标准质控菌株 白色念珠菌ATCC10231由江西省临检中心提供。

1.3 培养基 (1)真菌药敏专用琼脂：温州康泰生物科技有限公司产品，专门用于酵母菌的药敏纸片法试验，主要成分含PRMI1640琼脂粉，葡萄糖，缓冲液，抑菌剂。培养基使用了标准培养皿 (直径9cm)，琼脂厚 0.5cm，pH7.0。(2)M-H 改良琼脂：美国辉瑞公司推荐用于氟康唑真菌药敏试验纸片法的药敏培养基。含10.8gM-H琼脂粉，6g葡萄糖，亚甲蓝(1mg/ml)200μl，1g科玛嘉。 经 121℃，15min 高压灭菌后，水浴55℃后使用了标准培养皿 (直径9cm)，倒琼脂厚0.5cm备用。

1.4 抗菌药物纸片 温州康泰生物科技有限公司的BIO-KONT抗真菌药敏纸片：两性霉素B、氟康唑、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑和咪康唑。

1.5 纸片扩散法 使用的2种琼脂培养基均采用相同的方法步骤。在药敏试验前，菌株需作纯化分离，以保证实验的准确性和可靠性；将每个菌株都转到法国科玛嘉显色培养基上，35℃生长24h。按照BIO-KONT产品说明书配制菌液：用直接菌落悬液法制备浓度为(5×105)CFU／ml的菌悬液(先配0.5麦氏浊度，再用生理盐水1:1稀释)；对于克柔念珠菌则要先配0.5麦氏浊度，再用生理盐水1:10稀释；对于新生隐球菌，配1.0麦氏浊度，无需稀释。在接种前，平板先置35℃干燥20～25min。吸0.5ml菌悬液，倾注于平板表面，用接种棉棒涂布均匀，多余的液体用棉签或移液管移走。然后，平放平皿，在35℃干燥10min,贴纸片。最终要求，在琼脂表面，菌落恰好呈融合生长。培养24h后立即测量抑菌圈，测量时间＜24h。因此，对于氟康唑和伊曲康唑，用相应不同的培养时间，如果对于某些菌株在培养过夜后未见生长，那么应再培养24h，而对于隐球菌属在30℃培养24～48h。

1.6 结果判读 培养18～24h后用刻度尺测量抑菌环直径.如M-H琼脂平板上有部分菌株生长不良，可再培养24h后观察结果。多烯类抗真菌药物(两性霉素B)测量清晰的抑菌环直径，抑菌环内出现的为耐药突变株。按温州康泰真菌药敏试验操作说明书判读结果。

1.7 统计学方法 采用χ2检验。

2 结果

2.1 两种培养基检测193株酵母菌对5种抗真菌药物的药敏试验结果 两性霉素B：180株酵母菌对两者均敏感，2株耐药，11株中敏，符合率达到99.4%(χ2=0,P>0.05)； 氟康唑：169 株对两者均敏感，8株均耐药，16株中敏，符合率为89.5%(χ2=0.5，P>0.05);5-氟胞嘧啶：50株对两者均敏感，12株均耐药，2株中敏，两者的符合率为33.14%(χ2=143,P<0.01)；伊曲康唑：162株对两者均敏感，10株均耐药，13 株中敏， 符合率为 95.89%(χ2=6.13，P>0.05);咪康唑：16株对两者均敏感，30株耐药，146株中敏，符合率为 99.47%(χ2=0，P>0.05)

2.2 193株念珠菌对5种抗真菌药物的敏感性试验结果 见表1，其总敏感性两性霉素B为93.3%，氟康唑敏感性为87.56%，5-氟胞嘧啶敏感性为25.9%，伊曲康唑敏感性为83.93%，咪康唑敏感性为8.3%。

2.3 标准菌株用真菌药敏专用琼脂平板试验结果每批所测得抑菌环直径均在规定的范围内，且重复性较好，抑菌圈直径之差<2mm。

表1 193株酵母菌对5种抗真菌药物敏感性试验结果

3 讨论

纸片扩散法抗真菌药物敏感试验具有操作简单、快速、结果直观和适合临床常规标本检测的特点。温州康泰抗真菌药敏片被公认为是较好的真菌药敏试剂。它与其公司生产的真菌药敏专用琼脂组合可以得到稳定、清晰的实验结果。但真菌药敏专用琼脂价格较贵。我们实验室根据他人的经验在以M-H琼脂配制的培养基中加入1g科玛嘉。根据实验结果显示，除了5-氟胞嘧啶在M-H改良琼脂上的判读结果与CLSI相差甚远，其他药敏纸片的结果与CLSI的符合率都较高[5]。这与徐修礼等[6]的报道一致，与陈翠敏的报道有差异[7]。咪康唑药敏试验的敏感性较低，但是其在两种培养基上的耐药株较多，因此其符合率较高，这与咪康唑长期大量使用耐药有关，现在临床基本不再使用咪康唑。根据此次实验结果，本实验室的药敏试验不再使用咪康唑药敏纸片。与真菌药敏专用琼脂相比较，除外5-氟胞嘧啶纸片，其他纸片的符合率都较高，但由于用真菌药敏专用琼脂的成本高于M-H改良琼脂，M-H亚改良琼脂用于温州康泰公司的BIO-KONT抗真菌药纸片法操作简便、观察时间短、成本低廉，能及时的为临床提供有利的参考资料，也是值得在临床上推广的一种药敏试验筛选方法。所以，建议将M-H改良琼脂用于除外5-氟胞嘧啶 BIO-KONT抗真菌药纸片法，可以代替真菌药敏专用琼脂。在BIO-KONT纸片扩散实验中，结果判读方面存在着一些不足：(1)对于多烯类抗真菌药如：两性霉素B，抑菌圈较清晰，结果较好判读；(2)对于咪唑类抗真菌药，在正常生长菌落形成的抑菌圈内，可能会出现由较小的部分被抑制的菌落形成的抑菌圈，测量时以正常生长的菌落(80%生长处)形成的抑菌圈为准，其内部的较小菌落不应视为突变株。在温州康泰纸片扩散实验中也应注意培养时间对药敏结果的影响，培养18～24h后应马上测量抑菌圈，因为培养时间过长会导致假耐药，特别是对于咪唑类药物。即培养过夜后应检查平板，如果抑菌圈清晰，应马上测量。如果对于某些菌株在培养过夜后未见生长，那么应再培养24h。这些不足对本次试验结果也有着一定的影响。

肿瘤目前认为是一种慢性疾病,肿瘤患者的一般状态差,免疫功能低下,特别是细胞免疫功能低下,加之住院期间长期使用抗生素，放、化疗也损害了机体免疫屏障,更易发生真菌医院感染,严重影响了患者的生存质量。医院感染已成为现代医学研究的突出课题。真菌感染的复杂性和不断出现新的机会致病真菌,且感染难以控制,常成为终末感染而导致病人死亡,早期发现和诊断真菌感染,提高真菌检测水平,是降低肿瘤病人死亡率的重要措施。如何快速、准确的分离、鉴定，并给予耐药性报告，这就迫切要求人们关注、重视。总之，我们要从源头上控制并减少真菌感染的发生、发展，是需要多方面的通力协作，特别是当今滥用抗菌药物的情况，应予以根除。与此同时，规范化技术操作以及优良且先进的实验方法应用需提高。

[1]李若瑜，王端礼.密切结合临床，提高真菌学检验水平[J].中华检验医学杂志，203，26(9):521-523.

[2]NationaI committee for Clinical Latoratory Standards.Reference method for broth dilution antifugal susceptibility of yeasts[S].M-27A.CLSI,1997：l-13.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Zone diameter interpretive standards and corresponding minimal inhibitory concentration(MIC)interpretive breakpoints[S].N=M44-si.CLSI.2006.

[4]刘锦燕，项明洁.抗真菌药物敏感性试验方法研究进展[J].检验医学，2009，24(12)：927-931.

[5]A Espinel-Ingroff，E Canton，D Gibbs，et a1.Correlation of Neo—Sensitabs tablet diffusion assay results on three different agar media with CLSI broth microdilution M27-A2 and disk diffusion M44-A results for testing susceptibilities of Candida spp.and Cryptococcus neoformas to amphoteriein B，caspofungin，fluconazole，itraconazole，and voriconazole[J].journal of clinicl Microbiologg,2007,45(3):858-864

[6]徐修礼,杨佩红,孙怡群,等.真菌药敏纸片扩散法实验与应用研究[J].临床检验杂志，2006，24(4)：278-279.

[7]陈翠敏,府伟灵,张晓兵,等.抗真菌药敏试验在3种不同琼脂平板的比较[J].中华医院感染学杂志，2006，16(11)：1307-1309.

R446.5,Q939.92,R978.5

B

1674-1129(2012)04-0407-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.046