大鼠AQP7基因重组腺病毒载体的构建及其在3T3-L1脂肪细胞中的表达

潘伟，谷雪梅，沈飞霞

（温州医学院附属第一医院 内分泌科，浙江 温州 325000）

大鼠AQP7基因重组腺病毒载体的构建及其在3T3-L1脂肪细胞中的表达

潘伟，谷雪梅，沈飞霞

（温州医学院附属第一医院 内分泌科，浙江 温州 325000）

目的：构建携带大鼠AQP7基因的腺病毒载体，并检测其在3T3-L1脂肪细胞中的表达。方法：采用RT-PCR方法，从大鼠脂肪组织中扩增克隆大鼠AQP7基因，插入到穿梭质粒中获得重组质粒pDC316-AQP7。PCR、酶切鉴定后，重组穿梭质粒和骨架质粒经脂质体2000转染293细胞出毒产生重组腺病毒。经PCR进行鉴定，转染293细胞扩增并纯化，半数组织培养感染剂量（TCID 50）方法测定腺病毒滴度。体外转染分化成熟的3T3-L1细胞，用Western blot方法检测AQP7的表达水平。结果：PCR、酶切及测序证实重组穿梭质粒构建正确。同时成功构建AQP7重组腺病毒，并制备出高滴度的病毒保存液，可以有效转染3T3-L1细胞。结论：成功构建了含大鼠AQP7基因的重组腺病毒载体且其可以在3T3-L1细胞中有效表达，为今后更好地研究AQP7在肥胖发生发展过程中的调控机制奠定了基础。

水通道蛋白7；重组腺病毒；3T3-L1细胞；大鼠

水通道蛋白7（AQP7）为近年来发现的肥胖相关基因，其在脂肪组织中大量分布，参与甘油转运而影响脂肪代谢，与肥胖形成关系密切。多项研究[2-4]显示，AQP7功能下降或缺失致使脂肪细胞中甘油堆积，进而促进甘油三酯的合成，引起糖脂代谢紊乱，最终可能导致肥胖和（或）2型糖尿病的发生。AQP7对甘油的运输作用使人们对肥胖有了新的认识，从而对肥胖的研究进入一个崭新的领域。通过选择性增加脂肪细胞AQP7的表达，可望在肥胖治疗方面发挥重要作用。正如文献[5]报道给机体补充AQP1，可以有效治疗干燥综合征。

近来兴起的基因治疗为肥胖的防治提供了新的思路，但目前关于AQP7基因腺病毒载体的构建国内外亦鲜有报道。3T3-L1脂肪细胞是体外研究糖脂代谢和相关药物作用机制的重要模型。既往研究显示3T3-L1细胞表面腺病毒受体水平过低以致腺病毒转染效率低下[6]，因此，本研究在体外条件下转染AQP7基因重组腺病毒载体的时候加用多聚赖氨酸来增加腺病毒与3T3-L1细胞的黏附，进而观察3T3-L1细胞中AQP7的表达，为进一步探讨AQP7在肥胖发生、发展过程中的作用机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF级雄性SD大鼠5只（200～250 g），购自温州医学院实验动物中心；3T3-L1细胞购自中国科学院细胞库；AdMax腺病毒包装系统购自北京本元正阳基因有限公司；感受态DH5α由本实验室自备；限制性内切酶购自New England Biolabs公司；T4 DNA连接酶购自MBI公司；脂肪组织RNA提取试剂盒购自QIGEN公司；逆转录试剂盒、DNA marker DL2000和DNA片段回收试剂盒购自Takara公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；PCR纯化试剂盒购自V-gene公司；PCR引物合成及DNA序列分析由北京本元正阳基因技术有限公司完成；胰岛素（INS）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、多聚赖氨酸购自Sigma公司；兔抗鼠AQP7多克隆抗体购自Abcam公司；β-actin抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取：取新鲜大鼠内脏脂肪组织100 mg于液氮中反复碾磨成粉末样，按试剂盒操作说明提取脂肪组织总RNA。

1.2.2 RT-PCR克隆AQP7基因：取1μg RNA按照逆转录试剂盒说明合成cDNA链，然后以此单链为模板进行PCR反应。根据GenBank中AQP7的核苷酸序列（NM_019157.2）设计引物：上游引物序列为5’- ACT TAGCGGCCGCATGGCCGGTTCTGTGCTGGAGAACATACA-3’（下划线为NotI酶切位点），下游引物序列为5’-ACTTAAAGCTTCTAAGAACCCTGTGGTGGTATGCCGGCG-3’（下划线为HidIII酶切位点）。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30次循环后72 ℃延伸5 min，扩增后产物对比DL2000明确目的条带大小，按照胶回收试剂盒说明回收AQP7基因片段。

1.2.3 重组腺病毒pDC316-AQP7穿梭质粒的构建：pDC316质粒和AQP7基因分别经NotI和HindIII 37 ℃双酶切3 h后，用凝胶提取试剂盒回收相应片段，在T4 DNA连接酶25 ℃室温连接3 h。取5 μL连接产物热休克法转入感受态大肠杆菌DH-5α，接种到含有氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，次日挑取白色阳性单克隆菌落摇菌，提取重组质粒pDC316-AQP7。重组质粒PCR扩增产物电泳鉴定，续用NotI和HindIII双酶切，取8μL酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳、鉴定。测序结果通过NCBI上BLAST比对分析。

1.2.4 双质粒共转染293细胞，同源重组产生重组腺病毒：转染前一天，把293细胞接种到6孔板内，每孔5×105个细胞，培养基为含10% Hyclone胎牛血清的DMEM，37 ℃含5% CO2的培养箱中培养过夜。待细胞生长至底面积的80%～90%时进行转染。转染当天更换新鲜培养基，取骨架质粒pBHGlox_E1，3Cre和重组穿梭质粒pDC316-AQP7，按照Lipofectamine 2000脂质体说明书进行转染。转染次日将长满的细胞传代于25 cm2细胞培养瓶中，用含5%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75 cm2细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将出毒的细胞培养瓶先后置于-70 ℃冰箱和37 ℃水浴锅中反复冻融三次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液3000 r/min离心5 min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为第一代毒种（P1），作为随后大量病毒扩增的毒种。

1.2.5 Ad5-AQP7病毒毒种鉴定：待25 cm2细胞瓶中培养的293细胞生长至90%时，取上述第一代毒种500μL接种。待细胞完全病变时按前述方法冻融3次，离心收集病毒上清液，此即为第二代毒种（P2）。取50μL P2毒种上清液，加入2μL蛋白酶K，56 ℃温育，煮沸10 min，冰浴冷却，取1μL作为模板，进行PCR鉴定。上游引物5’-TTCCACAATGG CCGGTTCTGT-3’，下游引物5’-TCCAATCTCTAAGAACCCT GT-3’，产物大小824 bp。以不携带目的基因片段的pDC316质粒转染293细胞获得的腺病毒粗提液为阴性对照。

1.2.6 Ad5-AQP7重组腺病毒生产和纯化：病毒生产过程：在75 cm2方瓶中接种4×106293细胞，培养过夜，待细胞生长至90%，取2 mL P2代毒种接种培养瓶内，44 h后显微镜下观察细胞完全病变。收获病变细胞混悬液后反复冻融3次，离心取上清，按同样方法接种于另外75 cm2方瓶中直至收获足量病变细胞混悬液。

病毒纯化方法：细胞混悬液3000 r/min离心10 min，弃上清，细胞沉淀用Tris缓冲液重悬，反复冻融3次，6000 r/min离心后取上清，用DNase酶消化后，经 0.45μm的滤膜过滤，然后进行柱纯化。离子交换纯化后，然后再用分子筛进一步纯化，将纯化后的病毒保存于腺病毒保存液中，经除盐处理后用0.22μm一次性滤器过滤出菌，用从而得到无菌的纯化病毒，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.7 纯化病毒的滴度测定：①用10×的病毒裂解液裂解纯化病毒样品，测定OD260和OD280值，计算每毫升制品中的病毒颗粒数（VP/mL）=OD260×1.1×1012。②参照LaBarre等[7]方法测定病毒制品的TCID 50值。

1.2.83 T3 -L1细胞的培养及诱导分化：3T3-L1前脂肪细胞用10%新生小牛血清的高糖DMEM培养基在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，待细胞融合2 d后，加含有0.5 mmol/L IBMX、1μmol/L DEX和5μg/mL INS的10% FBS的DMEM培养48 h，更换含5μg/mL INS的培养基再培养48 h，随后用10% FBS的DMEM培养基继续培养，2 d换液一次，至细胞分化为成熟的脂肪细胞。

1.2.9 重组腺病毒Ad5-AQP7转染3T3-L1细胞及Western blot法检测蛋白表达：参考Orlicky等[6]的方法，在DMEM培养基中加入多聚赖氨酸溶液成终浓度0.5μg/mL，加入病毒液（MOI为300），室温静置100 min。PBS洗板2次后六孔板内每孔加入上述包含病毒溶液，37 ℃培养箱内放置1.5 h后每孔另加DMEM补足。24 h后更换为10% FBS的DMEM培养基。

培养72 h后吸弃培养基，用预冷PBS洗涤细胞2次后，每孔加入细胞裂解液100μL，刮起细胞，细胞悬液过27G针头数次，冰上静置30 min后12000 r/min 4 ℃离心20 min，吸取上清用BCA法测定蛋白浓度。蛋白置于-80 ℃冰箱保存。电泳前按4:1体积比与5×loading buffer 混合，100 ℃ 热变性5 min。取50μg蛋白上样12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，一抗AQP7（1:500）或β-actin（1:3000）4 ℃孵育过夜，次日与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h后，加ECL试剂反应，显像，成像。

2 结果

2.1 AQP7 cDNA PCR结果 PCR产物经电泳后在750～1000 bp之间有条带明显，与预先设计的AQP7 DNA长度相符，而阴性对照未见扩增条带（见图1）。

2.2 重组质粒pDC316-AQP7鉴定

2.2.1 重组质粒PCR鉴定：重组pDC316-AQP7质粒扩增后电泳，出现810 bp大小条带，阳性质粒构建成功（见图2）。

图2 pDC316-AQP7质粒PCR鉴定

图3 重组pDC316-AQP7质粒双酶切鉴定

2.2.2 双酶切鉴定：经NotI+HindIII双酶切后凝胶电泳观察到5.8 kb和810 bp大小2个片段，与预期结果相符，该质粒经酶切鉴定正确（见图3）。

2.2.3 测序鉴定：经测序比对分析，其核酸序列与GeneBank中AQP7的mRNA编码序列（NM_019157.2）同源性完全一致。

2.3 重组腺病毒Ad5-AQP7的包装和鉴定

2.3.1 重组腺病毒包装：双质粒共转染293细胞8 d后出现细胞病变效应，表现为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑（见图4）。

图4293 细胞出毒现象（×200）

2.3.2 Ad5-AQP7毒种PCR鉴定：提取P2病毒毒种的DNA进行PCR，同时用pDC316-AQP7质粒作为阳性对照，可以扩增出824 bp大小的基因片段，证实该重组病毒含有目的基因，而作为阴性对照的不携带AQP7基因的空载腺病毒没有扩增条带（见图5）。

图5 Ad5-AQP7毒种PCR鉴定

2.3.3 Ad5-AQP7病毒滴度测定：检测结果显示重组腺病毒颗粒数为7.36×1011VP/mL，TCID50免疫法测得感染滴度为1.58×1010IU/mL，分装冻存以备后续实验。

2.4 重组腺病毒在3T3-L1细胞中的表达 分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中可见AQP7的表达，转染Ad5-AQP7重组腺病毒后其含量明显升高（P＜0.01）（见图 6）。

1.分化成熟3T3-L1脂肪细胞；2.转染空载腺病毒；3.转染Ad5-AQP7与1组比：aP<0.01

3 讨论

自1988年Agre等在鉴定人类Rh血型抗原时偶然发现了一种红细胞膜上的新28 ku 蛋白，即后来被命名的AQP1以来，至今在哺乳动物中已发现13种水通道蛋白（AQP 0～12）。这些AQPs在通透水的功能上有着相似之处，但由于表达部位及含量的不同，又发挥着各自特异的生理功能。AQP7作为其中一员，除了可以运输水分子之外，还可以运输甘油、尿素等小分子物质，此基因最早从人的脂肪细胞中克隆成功，由于其mRNA水平在脂肪组织中表达丰富，故又被命名为脂肪水通道蛋白（aquaporin adipose，AQPap）。在体外培养发现随着3T3-L1细胞分化进程，AQP7 mRNA水平表达逐渐上升，并且培养基中甘油浓度也平行增加，这种效应可以被水通道蛋白的非特异性拮抗剂汞离子所阻滞，表明AQP7主要介导脂肪动员产生的甘油输出过程[8]。Hibuse等[3]用RNAi敲除AQP7的3T3-L1细胞发现，胞内甘油含量上升，油酸摄取增加，甘油激酶活性提高，从而促进甘油三酯的合成导致细胞内甘油三酯的蓄积促成脂肪细胞的肥大。这些结果显示AQP7在调控脂肪代谢方面起着关键的媒介作用，与肥胖的形成关系密切。

基因治疗是当今医学研究中最具前景的研究之一，而腺病毒载体是近年来发展起来的基因运载系统。其优点突出，对分裂和非分裂细胞均可以转染，感染能力强，外源基因容量大，不整合到宿主基因组，此外，相比慢病毒、逆转录病毒还具有病毒滴度高，易于操作等优点[9]。本实验选用AdMax腺病毒包装系统，通过Cre/loxP获得重组病毒，这个过程发生在293细胞中，从而避免在细菌中重组，操作简便、重组效率高以及可以获得较高的病毒产率。本实验通过此腺病毒包装系统，获得高纯度、高滴度的Ad5-AQP7重组腺病毒，经过鉴定构建成功，足够满足后续的细胞和动物要求。

3T3 -L1细胞系是3T3的一个亚型，有自发分化为脂肪细胞的特性，但自发分化率较低。加入具有促成脂作用的诱导剂后，大部分细胞可以分化为成熟脂肪细胞。与Orlicky等[6]研究结果一致，通过多聚赖氨酸可增加腺病毒与3T3-L1细胞的黏附力并且在细胞中高效稳定表达，实验结果证实重组腺病毒在3T3-L1细胞中得到表达。本研究成功构建大鼠AQP7重组腺病毒，并稳定转染3T3-L1细胞，为进一步研究AQP7与脂肪代谢的相关性奠定了良好实验基础，并对疾病的基因治疗有一定的指导意义。

[1] Arner P. Human fat cell lipolysis: biochemistry, regulation and clinical role [J]. Best Practice Research Clin Endocrinol Metab,2005,19(4):471-482.

[2] MacDougald OA, Burant CF. Obesity and metabolic perturbations after loss of aquaporin 7, the adipose glycerol transporter [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(31):10759-10760.

[3] Hibuse T, Maeda N, Funahashi T, et al. Aquaporin 7 deficiency is associated with development of obesity through activation of adipose glycerol kinase [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(31):10993-10998.

[4] Hara-Chikuma M,Sohara E,Rai T,et al. Progressive adipocyte hypertrophy in aquaporin-7-deficient mice: adipocyte glycerol permeability as a novel regulator of fat accumulation[J]. J Biol Chem,2005,280(16):15493-15496.

[5] 杨军, 杨彦春. 腺病毒介导AQP1基因治疗涎腺干燥综合征的实验研究 [J]. 重庆医学, 2005, 34(3): 323-235.

[6] Orlicky DJ, Schaack J. Adenovirus transduction of 3T3-L1 cells [J]. J Lipid Res,2001,42(3):460-466.

[7] LaBarre DD,Lowy RJ. Improvements in methods for calculating virus titer estimates from TCID50 and plaque assays[J]. J Virol Methods, 2001, 96( 2) : 107-126.

[8] Kishida K, Kuriyama H, Funahashi T, et al. Aquaporin adipose, a putative glycerol channel in adipocytes [J]. J Biol Chem,2000,275(27):20896-20902.

[9] Campos SK, Barry MA. Current advances and future challenges in adenoviral vector biology and targeting [J]. Curr Gene Ther,2007,7(3):189-204.

Construction of rat AQP7 recombinant adenovirus vector and its expression in 3T3-L1 cells

PAN Wei，GU Xuemei，SHEN Feixia.Department of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

Objective:To construct the recombinant adenovius vector carrying rat AQP7 and transfect the 3T3-L1 cells.Methods:The full cDNA sequence was obtained from rat adipose tissue using RT-PCR. The AQP7 gene was inserted into pDC316 shuttle plasid in order to produce recombinant pDC316-AQP7. After the identification of PCR，restriction endonuclease digestion and sequencing，the recombinant pDC316-AQP7 shuttle plasid coinfected with rescue plasmid into 293 cells by Lipofectamine 2000. The recombinant adenovirus vector(Ad5-AQP7)was confirmed by PCR，and then amplified in 293 cells and purified. The titer was used 50% tissue culture infective dose(TCID)assay. 3T3-L1 cells were transfected with Ad5-AQP7 and the expression of AQP7 gene was detected with Western blot.Results:PCR，restrition endonuclease digestion and sequencing analysis confirmed the construction of pDC316-AQP7 shuttle plasmid.Recombinant adenovius with high titer was produced and could express efficiently in 3T3-L1 cells.Conclusion:Recombinant adenovirus vector carring rat AQP7 gene(Ad5-AQP7)is success-fully constructed and can be expressed in 3T3-L1 cells，which may provide a potent tool to investigate the function of AQP7 during the development of obesity.

AQP7；adenovirus；3T3-L1 cells；rats

Q784

A

1000-2138（2012）06-0521-05

2012-01-26

浙江省自然科学基金资助项目（Y2080418）。

潘伟（1985-），女，浙江温州人，硕士生。

沈飞霞，主任医师，硕士生导师，Email：sfx 301@163.com。

丁敏娇）

·临床经验·