天津市公安特警总队特警足部红色毛癣菌种内基因分型

高晖，陈敬，黄永，杨哲，刘倩，王政雄，陈爽

（1.天津市公安医院，天津 300042；2.天津中医药大学，天津 300193）

天津市公安特警总队特警足部红色毛癣菌种内基因分型

高晖1，陈敬1，黄永1，杨哲1，刘倩1，王政雄1，陈爽2

（1.天津市公安医院，天津 300042；2.天津中医药大学，天津 300193）

目的对从公安特警总队特警足部浅表真菌病分离鉴定的红色毛癣菌，应用聚合酶链式反应(polymerase chain reation,PCR）技术比较分离自不同个体的红色毛癣菌菌株种内差异性，并分析其同源性。方法分别用文献报道的2对引物特异扩增红色毛癣菌的串联重复亚元件（tandem repeatsubelement,TRS）TRS-1/TRS-2产生的PCR指纹图谱进行比较分析种内差异性，2对引物分别为：TRS-1区引物TrNTSF-2：5’-ACCGTATTAAGCTAGCGCTGC-3’，TrNTSR-4：5’-TGCCACTTCGA TTAGGAGGC-3’。TRS-2区引物TrNTSR-1：5’-CTCAGTCGAACCGTGAGGC-3’，TrNTSC-1：5’-CGAGACCACGTGATACATGCG-3’。结果红色毛癣菌的种内分型：分离菌株TRS-1分型为type1型的占60.0%（15/25），与文献报道相比较差异有统计学意义（P<0.05）；分离菌株TRS-2扩增为单502 bp产物的占92%（23/25）；综合TRS-1和TRS-2分离菌株之间基因型有差异者占56%（14/25）。结论通过对红色毛癣菌种内分型，显示特警足部浅表红色毛癣菌感染具有较大的同源性；提示感染源比较集中，有必要采取正确的健康教育宣传。

警察；红色毛癣菌；分子分型

皮肤癣菌的种内分型有许多潜在的临床和流行病学应用，其可使我们能更深入地研究这些真菌的流行病学和致病性及确定传染源。科研利用毛癣菌保守区域——真菌核糖体脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA)(rDNA)的非转录间隔区（nontranscribed spacer region,NTS）中串联重复亚元件（tandem repeat subelement,TRS）区的差异，应用特异性引物对致病菌中发病率最高的红色毛癣菌（trichophyton rubrum,T.rubrum）进行种内基因分型，探讨感染来源、传播途径等流行病学问题，分析其同源性，并根据研究结果对特警的工作、宿舍环境、个人卫生习惯给予指导性的建议及干预，以保障特警的身体健康。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 实验菌株为我科门诊2009年7月—2010年10月天津市区正常体检的公安特警总队不同特警中分离的临床菌株25株；质控菌株来自于天津医科大学总医院皮肤科，包括近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）ATCC22019，克柔念珠菌（Candida krusei）ATCC6258。

1.2 试验方法

1.2.1 引物 引物由上海生物工程有限公司合成。TRS-1区引物TrNTSF-2：5’-ACCGTATTAAGCTA GCGCTGC-3’，TrNTSR-4：5’TGCCACTTCGATTAG GAGGC-3’。TRS-2区引物TrNTSR-1：5’-CTCAGT CGAACCGTGAGGC-3’，TrNTSC-1：5’-CGAGACCA CGTGATACATGCG-3’。

1.2.2 主要试剂和设备 Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒（BioFlux Co.Ltd.，Japan），琼脂糖电泳标准分子质量Marker（润泰生物工程有限公司dl15 000），聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）反应混合液（广东东盛生物技术有限公司），基因扩增仪（EppendorfMastercycler pro梯度PCR仪，德国）。

1.2.3 提取DNA和PCR 应用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒规定的程序提取rDNA。总体积25μL，模板DNA 2μL、每条引物1μL、PCR反应混合液12.5mL（包含1.25U TaqDNA聚合酶、500μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-Cl PH8.3)，100 mmol/L Kcl，3 mmol/LMgCl2），双蒸水补足25μL。94℃预变性3 min。94℃变性30 s，45℃复性45 s，72℃延伸1 min，共30个循环。最后72℃延伸7min。取5μL基因组DNA与1μL溴酚兰染液混合，点样于0.8%琼脂糖凝胶孔中（GoldViewTM做核酸染料）；取PCR产物与DNA Ladder各5μL，点样于电泳槽内浓度为1.8%琼脂糖凝胶孔中；在120 V电压下电泳30min，然后将凝胶置于紫外光灯箱内，紫外光照射下观察显像结果，并拍摄储存图像。

1.3 统计学处理 样本率的比较使用2项分布检验。

2 结果

红色毛癣菌核糖体DNA内的NTS有2个串联排列的重复亚单位TRS-1和TRS-2，在不同菌株内这两个重复序列的拷贝数不同，所以在株间存在分子多态性。应用引物TrNTSF-2和TrNTSR-4扩增TRS-1，引物TrNTSR-1和TrNTSC-1扩增TRS-2。根据对PCR产物的电泳条带分析，判断这个单位内不同感染个体的分离菌株之间是否有差异。

25株分离菌株通过PCR扩增出的TRS-1区产物带型比较结果显示，2、4、6、7、8、12、14、15、16、17、18、20、22、23、25号分离菌株为 type1型占60.0%（15/25），9、13、21分离菌株为type2型占12%（3/25），1、10、24分离菌株为type3型占12%（3/25），其他类型 3、5、11分离菌株占 12%（3/25）。与Jackson[4]得到的结果type 1型占40%进行2项分布检验，P=0.034（单侧），差异有统计学意义。

25株分离菌株通过PCR扩增出的TRS-2区产物带型比较结果显示，1、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25分离菌株单502 bp产物占92%（23/25），其他类型2、3号分离菌株占8%（2/25）。与Jackson[4]得到的结果单502 bp产物占86%进行2项分布检验，P=0.30（单侧），差异无统计学意义。

综合TRS-1和TRS-2 2个区的扩增结果来看，4、6、7、8、12、14、15、16、17、18、20、22、23、25号分离菌株之间带型无差异，占56%（14/25）。

TRS-1扩增结果，见图1。

3 讨论

在我们前期的科研中发现，305名特警的流行病学调查发现天津市内特警足部真菌病发病率达54.75%，其中红色毛癣菌占76.67%，比较特警内不同患者之间致病的红色毛癣菌是否有差异可以说明致病菌是否在特警内传染造成。因此，有必要对红色毛癣菌的病原学进行更深入地研究。

目前真菌的基因水平研究使用的方法有：各种聚合酶链式反应，随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）[5-6]，限制性酶切片断长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism,RFLP）[7]，任意引物聚合酶链式反应（arbitrarily primed polymerase chain reaction,APPCR）、微卫星基因分型法，基因探针等[8]。真菌通用引物扩增核糖体DNA做序列分析、RFLP、基因探针等可将真菌鉴定到种的水平；RAPD或AP-PCR、菌株高变异区DNA序列分析、特异引物PCR、基因探针可以将其基因分型以体现种内不同菌株之间有无基因水平差异，但RAPD、微卫星分型等扩增产物的种间差异大于种内差异，且AP-PCR产生的带型复杂，较适用于做种间的鉴别[2，9]。

皮肤癣菌的种内分型有许多潜在的临床和流行病学应用，其可使我们能更深入地研究这些真菌的流行病学和致病性及确定传染源。红色毛癣菌是皮肤癣菌中最常见的致病菌，由于红色毛癣菌株间变异性存在于核糖体DNA内的非转录间隔区NTS[8]，NTS区内的两个串联亚重复序列TRS-1/TRS-2，在不同菌株内这两个重复序列的拷贝数不同，是株间PCR指纹图谱差异的分子基础，重复单位基因测序结果证实了这一点。因此用特异引物扩增TRS区然后做PCR指纹图谱分析能更好地显示出红色毛癣菌种内差异。Jackson等[4]设计了巢式PCR扩增红色毛癣菌的TRS，引物TrNTSF-2和TrNTSR-4用来扩增TRS-1，引物TrNTSR-1和TrNTSC-1用来扩增TRS-2，从而给红色毛癣菌进行种内基因分型。有研究使用TRS区的引物直接对TRS区进行一步扩增具有相同的结果[1，3]，故本实验采取一步法扩增红色毛癣菌的TRS。

从实验结果可以看出，特警足部浅表真菌红色毛癣菌TRS-1中type 1型占60%，与Jackson得到的结果type 1型占40%进行比较，具有显著性差异。说明特警足部浅表真菌病红色毛癣菌种内差异较文献报道的要小，具有较大的同源性，分析原因可能与特警经常训练、常有高温高湿环境，个体相互传染有关。因此，有必要采取正确的健康教育宣传，加强足部浅表真菌病的预防工作。

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［5］成晓茹，吴爱军，张建秀，等.红色毛癣菌随机扩增DNA多态性分型研究[J].中华皮肤科杂志，2001，12，34（6）：448-449.

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Deoxyribonucleic Acid Typing of Trichophyton Rubrum from Special Policemen's Feet of Tianjin General Special W eaponsand Tactics

GAOHui1,CHENJing1,HUANGYong1,YANGZhe1,LIUQian1,WANGZhengxiong1,CHENShuang2
1.TianjinGong'anHospital,Tianjin300042,China;2.TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193, China

ObjectiveTo investigate the intraspecific difference of the trichophyton rubrum (T.rubrum)strainswhich separated from members of Tianjin general specialweapons and tactics(SWAT)that suffered from foot superficialmycosis, and to analysis their homology by polymerase chain reaction (PCR)method.MethodsTwo primers reported by documents were used to amplify the tandem repeatsubelement(TRS),and the fingerprintpatternsofPCR productswasapplied to analysis the intraspecific difference.The sequencesof the two primerswere as follows:TrNTSF-2:5’-ACCGTATTAAGCTAG CGCTG C-3’,TrNTSR-4:5’-TG CCACTTCGATTAGGAGGC-3’,TrNTSR-1:5’-CTCAGTCGAACCGTGAGGC-3’,and TrNTSC-1:5’-CGAGACCACGTGATACATGCG-3’.ResultsTRS-1 genotype:15 of25(60%)separated strainswere type 1,which was significantly different from literatures(P<0.05);TRS-2 genotype:23 of25 (92%)separated strains obtained a single 502 bp product.A syntheticalstudy revealed 14 of25(56%)separated strainshad the same gene type.ConclusionThe intraspecific subtype of T.rubrum revealed the greathomology in the infections amongmembers of Tianjin General SWAT. And itsuggested the sourceof infectionwasconcentrated and the correcthealth educationwasurgently needed.

policemen;trichophyton rubrum;molecular subtype

R512.91

A

1672－0709（2012）05-0275－04

天津市公安局科技资金资助课题（2010KYSGAY019）

陈敬，E-mail：gracejingchen@163.com

2012-06-11）