云南水晶石榴果皮中多酚组分及抗氧化活性分析*

孙丽平，张会林，杨美智子，刘洋铭，庄永亮

(昆明理工大学化学工程学院，食品工程研究中心，云南 昆明，650500)

石榴(Punica granatum)为石榴科石榴属植物，在我国栽培广泛。云南省蒙自、建水、巧家、呈贡等地的水晶石榴具有生长海拔高、日照时间长的自然优势，营养价值高［1］。目前，云南水晶石榴除鲜销外，主要生产石榴汁原浆，据悉，云南某石榴加工厂一年即可消耗石榴1.25万t，生产石榴汁原浆5 000 t。石榴果皮是加工副产物，占石榴鲜果重的50%左右，研究发现其含有丰富的多酚物质，且抗氧化活性很高，目前，学者已对河北［2］、新疆［3］、陕西［4－5］等地生产的石榴果皮中抗氧化物质进行了研究和报道，但是对云南水晶石榴的研究还很少。本文提取云南水晶石榴皮中的多酚物质，用Folin-Ciocalteu及HPLC法测定其多酚的含量、分析多酚的组成，并测定提取物的还原能力、DPPH自由基清除能力、抑制脂质体过氧化能力和清除亚硝酸能力等体外抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

采集云南产新鲜水晶石榴，收集果皮，60℃烘干，粉碎，过40目筛，备用。

甲醇，色谱级;大豆卵磷脂、1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals(DPPH·)、没食子酸、芦丁、绿原酸、原儿茶酸、山萘酸、槲皮素、水杨酸、苯甲酸、香兰素、木犀草素、咖啡酸、儿茶素、丁香酸、香豆酸、鞣花酸和阿魏酸，标准品级;其他为试剂为分析纯。

Agilent1200高效液相色谱仪(美国 Agilent公司)，TU1901型双光束紫外可见光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，78－1型磁力搅拌器(深圳市国华仪器厂)，LXJ-IIB型离心机(上海安亭科学仪器厂)，SB-5200DTD超声波清洗器(宁波新芝生物有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 多酚的微波辅助提取

准确称取一定量果皮粉，按1∶20(g:mL)料液比，加入体积分数为65%的乙醇溶液，480 W输出功率下微波处理45 s，过滤，取滤液定容至50 mL，制备多酚提取液。

1.2.2 多酚总量的测定［6］

采用Folin-Ciocalteu法测定果皮中多酚含量，以没食子酸为标准品。准确吸取不同浓度没食子酸标准工作液和多酚提取液各1 mL于10 mL试管中，然后依次加入1 mL去离子水，0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，1.5 mL Na2CO3(7.5%)溶液，最后用水定容至10 mL，在50℃水浴下保持10 min，冷却，在760 nm测吸光值。标准工作曲线方程为:y=0.008 6x+0.006 7，R2=0.998 6，其中 y为吸光度，x为没食子酸含量。果皮中多酚含量表达为mg/g(干重)。

1.2.3 多酚组成的测定

将1.2.1制备的多酚提取液进行微孔(0.45 μm)过滤，滤液进行酚类物质组成分析。色谱条件:Agilent1200高效液相色谱仪，配备自动进样器和光电二级阵列检测器;Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);流动相:A甲醇，B 0.3%磷酸溶液;梯度洗脱:0～70 min，A从0% ～100%，100%A保持10 min;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;检测波长:280 nm。不同浓度的没食子酸、芦丁、绿原酸、原儿茶酸、山萘酸、槲皮素、水杨酸、苯甲酸、香兰素、木犀草素、咖啡酸、儿茶素、丁香酸、香豆酸、鞣花酸和阿魏酸建立标准工作曲线，出峰时间定性，峰面积定量，分析提取液中多酚类物质的组成及含量。

1.2.4 提取液抗氧化活性测定

1.2.4.1 还原能力的测定

取1 mL稀释为一定浓度梯度的提取液，加入1 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀，50℃水浴20 min，取出，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀，迅速冷却。取1 mL混合液于5 mL离心管中，加入1mL超纯水和0.2 mL 0.1%的三氯化铁溶液，混匀，蒸馏水代替样品为空白，测定溶液在700 nm处的吸光度(A700)。以A700表示样品的还原能力，EC50值表示A700为0.500时多酚的浓度。

1.2.4.2 清除DPPH自由基能力测定

取0.4 mL稀释为一定浓度梯度的提取液，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液，混匀，暗处放置30 min并不断振荡，在517 nm处测其吸光度。0.4 mL水+2 mL甲醇为空白，0.4 mL蒸馏水代替样品为对照。清除率计算公式为:

1.2.4.3 抑制脂质体过氧化能力的测定

取1 mL稀释为一定浓度梯度的提取液，依次加入1.0 mL脂质体磷酸盐缓冲液分散系，1.0 mL 40 μm/L 三氯化铁溶液，1.0 mL 400 μm/L L-抗坏血酸，混匀，避光37℃水浴中60 min，再加入2.0 mL三氯乙酸-硫代巴比妥酸-盐酸混合液，沸水浴反应15 min，立即冷却，5 000 r/min离心10 min，取上清液在532 nm下测定吸光值。1 mL蒸馏水代替样品+1 mL磷酸盐缓冲溶液代替脂质体分散体系为空白，1 mL蒸馏水代替样品为对照，抑制率计算公式为:

1.2.4.4 亚硝酸盐清除能力的测定

取1 mL稀释为一定浓度梯度的提取液，加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，沸水浴30 min，取出，加入1 mL0.4%对氨基苯磺酸，混匀，静置5 min，加入0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，混匀，定容至25 mL，静置15 min后，在538 nm处测其吸光度。3 mL蒸馏水代替1 mL样品和2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液为空白，1 mL体积分数65%乙醇溶液代替样品为对照，清除率计算公式为:

1.2.5 数据统计方法

每个实验至少3次重复，测定结果表达为平均值±标准偏差。采用SPSS11.5软件对数据进行方差分析，差异显著性水平为P＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 云南水晶石榴果皮中多酚含量及其组成

云南水晶石榴果皮中的多酚含量及其组成见表1。总酚含量为99.60 mg/g(干重)，高于新疆和田产石榴［46.58 mg/g(干重)］［3］、陕西汉中产石榴［0.84 mg/g(干重)］［5］以及 Singh 等［7］和 Li等［8］报道的石榴果皮中多酚含量(4.13%和7.86%)，但低于陕西临潼产石榴(23.68%)［4］。其原因既与种属、产地有关，也与储运及提取方法的不同有关［9］。

表1 云南水晶石榴果皮中总酚含量、多酚组成及其含量

表1结果显示，云南水晶石榴果皮中共检出16种标准品的9种，其中香豆酸、儿茶素和原儿茶酸为主要成分，含量分别为4.80、3.96和1.96 mg/g(干重)。李国秀［4］在陕西产的石榴果皮中未检测到儿茶素，原儿茶酸含量也极低。

2.2 云南水晶石榴果皮多酚提取物的抗氧化活性

多酚类物质具有活泼的多羟基结构，从而具有较强供电子能力，使其成为有效的抗氧化活性成分，但多酚提取物抗氧化能力的强弱与其多酚组成及其配比有关［10］。由图1可以看出，云南水晶石榴果皮多酚提取物表现出很强的抗氧化活性，提取物在其还原能力EC50值时的浓度为23.00 μg/mL，在DPPH自由基清除能力、抑制脂质体过氧化能力和清除亚硝酸能力IC50值时的浓度分别为10.10、350.00和182.00 μg/mL。

由图1相关性分析可知，云南水晶石榴果皮多酚提取物的抗氧化活性与其浓度均在P＜0.01水平上显著相关，还原能力、DPPH自由基清除能力、抑制脂质体过氧化能力和清除亚硝酸能力的相关性系数(R2)在0.888 1～0.995 8。与陕西临潼产石榴果皮多酚提取物的抗氧化能力相比［4］，本文中云南水晶石榴果皮多酚提取物的还原能力较强，但是对DPPH的清除能力和脂质体过氧化抑制能力较弱，这可能是多酚提取物的组成不同及测定方法不一样［10］。

图1 云南水晶石榴果皮多酚提取物的抗氧化活性及其相关性

3 结论

(1)云南产水晶石榴果皮中富含多酚类物质，其总酚含量为99.60 mg/g(干重)。HPLC法检出提取物中有9种酚类物质，其中香豆酸、儿茶素和原儿茶酸是主要成分，含量分别为4.80、3.96和1.96 mg/g(干重)。

(2)云南水晶石榴果皮多酚提取物表现出很强的抗氧化活性，且多酚提取物的抗氧化活性与其浓度相关性显著(P＜0.01)，R2分别为0.995 8、0.888 1、0.983 3和0.985 6。结果表明，云南产水晶石榴果皮是一种很好的天然抗氧化物质资源。

［1］ 刘家富，周家齐，李晚谊，等.云南蒙自石榴主要成分分析［J］．云南农业科技，1995(6):20－23.

［2］ 胡淳淳，邵建柱，徐继忠，等.不同石榴品种及器官多酚含量的比较研究［J］．河北农业大学学报，2010，33(2):17－20.

［3］ 田树革，魏玉龙，刘宏炳.Folin-Ciocalteu比色法测定石榴不同部位总多酚的含量［J］．光谱实验室，2009，26(2):341－344.

［4］ 李国秀.石榴多酚类物质的分离鉴定和抗氧化活性研究［D］．西安:陕西师范大学，2008.

［5］ 李志洲，刘海军.石榴皮中多酚类物质的提取及其抗氧化性研究［J］．食品与发酵工业，2009，35(11):152－155.

［6］ Singleton V L，Rossi J A.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdicphosphotungstic acid reagent［J］．A-merican Journal of Enology and Viticulture，1965，16:144－158.

［7］ Singh R P，Chidambara Murthy K N，Jayaprakasha G K.Studies on the antioxidant activity of pomegranate(Punica granatum)peel and peed extracts using in vitro models［J］．Journal of Agriculture and Food Chemistry，2002，50:81－86.

［8］ Li Y F，Guo C J，Yang J J，et al.Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peel extract in comparison with pomegranate pulp extract ［J］．Food Chemistry，2006，96:254－260.

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［10］ Kalt W，Ryan D A J，Duy J C，et al.Interspecific variation in anthocyanins，phenolics and antioxidant capacity among genotypes of high bush and low bush blueberries(Vaccinium section Cyanococcus spp.) ［J］．Journal of Agriculture and Food Chemistry，2001，49:4 761 －4 767.