红曲霉ZL307固态发酵豆渣产γ－氨基丁酸的工艺优化*

张庆庆，吕闻闻，汤文晶，许鹏

(安徽工程大学生物与化学工程学院/微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖，241000)

γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质，广泛分布于整个神经系统中［1］。研究表明GABA具有治疗精神分裂症、帕金森病、高血压、肾机能和肝机能改善作用、增加生长激素分泌、健肝利肾和消臭等等［2－3］。

豆渣中含有膳食纤维、蛋白质及钙、磷、铁、维生素等微量的营养成分，具有很高的使用价值［4］。我国目前对豆渣的研究主要集中在一般性应用(如直接将豆渣用作油炸食品、烘烤食品等的辅料)和豆渣膳食纤维的研究等方面［5］，未能有效解决豆渣的综合利用问题，相当一部分豆渣由于含水量过大、处理不及时极易酸败发臭，不仅浪费大量的可利用资源，同时造成环境污染［6－7］。在红曲霉固态发酵产γ-氨基丁酸的研究过程中，目前大多采用大米作为原料［8－9］，而以豆渣为基质进行产 γ-氨基丁酸的研究较少。豆渣作为一种价格低廉的原料可以替代大米粉等用来发酵生产γ-氨基丁酸，不仅价格低廉，来源充足，同时能够解决废弃豆渣所造成的环境污染，为豆渣变废为宝开辟新的途径。

本文以红曲霉ZL307为发酵菌种，豆渣为主要原料，对红曲霉固态发酵生产γ-氨基丁酸的生产工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 菌种

红曲霉ZL307(Monascus ZL307)，由微生物发酵安徽省工程技术研究中心实验室保存。

1.2 培养基

斜面培养基:马铃薯20.00 g，葡萄糖2.00 g，琼脂2.00 g，自来水100 mL，pH自然。

种子培养基:葡萄糖6.00 g，蛋白胨 0.50 g，Mg-SO40.10 g，KH2PO40.25g，自来水 100 mL，pH 自然。

初始固态发酵培养基:20 g/250 mL锥形瓶，干豆渣12.00 g、大米粉 8.00 g，(NH4)2SO40.20%，Mg-SO40.25%，KH2PO40.25%，CaCl20.25%，谷氨酸钠0.30%(均为占固体基质的质量分数)，初始含水量50%(V/W)，初始pH值 6.0。

1.3 培养方法

种子培养:将保藏红曲霉菌种接入斜面培养基中恒温32℃，培养7 d。再将斜面菌种接入含100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，32℃，150 r/min恒温培养48 h。

固态培养:将红曲霉种子液接入固态培养基中，接种量20%(占基质干重)，温度32℃，恒温培养12 d。

1.4 分析方法

1.4.1 样品处理

固态发酵后的红曲制品烘干粉碎后加入10倍体积的蒸馏水，温度55℃，浸提3 h，4层纱布过滤滤液离心(4 000 r/min)5 min。取上清液，0.45 μm 微滤膜过滤，经衍生化处理后进样。

1.4.2 γ-氨基丁酸含量测定［10］

采用胶束毛细管电泳法(MEKC)，熔融石英毛细管柱50 μm×60 cm(有效长度50 cm)，异硫氰酸苯脂(PITC)为柱前衍生化试剂，100 mmol/L硼砂(pH 9.5)为运行缓冲液，分离电压25 kV，柱温20℃，检测波长250 nm。

1.5 试验设计

1.5.1 单因素实验

主要考察固体基质、含水量、pH值、温度对γ-氨基丁酸产量的影响。

1.5.2 Plackett-Burman实验

通过单因素试验和相关文献报道，影响γ-氨基丁酸产量的因素有大米粉、(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2、谷氨酸钠。选用 N=12的 Plackett-Burman设计，每个因素分别取低和高2个水平，高水平是低水平的1.5倍，响应值为 γ-氨基丁酸产量(Y)，因子编码水平表见表1，用SAS 9.2对实验数据进行回归分析。

表1 Plackett-Burman试验设计的因子编码水平表

1.5.3 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman实验结果进行主效应分析。并以各显著因素的正负效应确定下一步试验的最陡爬坡路径(包括变化方向和变化步长)，快速的逼近最佳区域。

1.5.4 响应面试验设计

根据Plaekett-Burman试验确定出了影响γ-氨基丁酸产量的主要因素，根据最陡爬坡实验确定接近响应值区域显著因素的浓度，接下来利用3因素3水平的Box-Behnken实验进行优化，以γ-氨基丁酸含量(mg/g)Y为响应值，用SAS软件对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 基质对γ-氨基丁酸产量的影响

表2为不同基质配比产γ-氨基丁酸结果，由表2可知，单纯使用豆渣，容易结块，γ-氨基丁酸含量较低，豆渣和米粉的质量比由9∶1变为6∶4过程中，米粉的增加可以迅速增加γ-氨基丁酸的含量，当配比为6∶4时，即占固体基质的40%时，γ-氨基丁酸产量达到最大，继续增加米粉含量，γ-氨基丁酸产量开始降低。可见过高的米粉含量不仅会造成原料的浪费，而且还会使产量下降。

表2 固体发酵基质对γ-氨基丁酸产量的影响

2.1.2 基质初始含水量对γ-氨基丁酸产量的影响

本实验研究了不同含水量对γ-氨基丁酸产量的影响，如表3所示，当含水量达到60%时，产量达到最大。通过统计学分析，含水量在40%～50%的变化过程影响极显著，在50% ～60%的变化过程中影响不显著。在60%～80%范围内产量逐渐下降。原因可能是水分过低，基质较干燥，菌体生长受到抑制，水分过多，基质出现结团，不利于菌体的呼吸，影响到氧的传递和发酵热的散失，极易发酸、发臭。

表3 基质含水量γ-氨基丁酸产量的影响

2.1.3 pH值对γ-氨基丁酸产量的影响

不同pH值对γ-氨基丁酸的影响如表4所示，pH值在4.5～5.5，γ-氨基丁酸产量缓慢增加，pH5.5时，产量最高，pH超过6之后产量开始下降。通过统计学分析，pH在4.5～5.5的变化过程影响不显著，pH 6～6.5的变化影响显著。原因可能是初始pH值过低时，抑制了菌体的生长代谢，从而对底物的利用率降低，γ-氨基丁酸产量明显减少。当初始pH值较高时，细菌生长良好，但代谢生产γ-氨基丁酸途径中关键酶活力不足，导致产量降低。

表4 pH值对γ-氨基丁酸产量的影响

2.1.4 温度对γ-氨基丁酸产量的影响

本实验考察了不同温度对红曲霉发酵产γ-氨基丁酸的影响，如表5所示，通过统计学分析γ-氨基丁酸产量影响，温度在24～32℃的变化过程影响极显著，36～40℃的变化过程影响也极显著。32℃时达到最大，之后开始下降。原因可能是温度过低，菌体生长缓慢，延滞期较长，生长周期延长。温度过高，菌体细胞的活力受到抑制，引起菌体的死亡，菌体生长受到抑制影响。

表5 温度对γ-氨基丁酸产量的影响

2.2 Plackett-Burman实验

由单因子实验可知，对红曲霉产γ-氨基丁酸有影响的因素有大米粉(X1)、(NH4)2SO4(X3)、MgSO4(X4)、KH2PO4(X5)、CaCl2(X6)、谷氨酸钠(X8)，分别作为PB实验的6个因素，加上3个因素用于估计误差(X2、X7、X9)，Plackett-Burman 设计试验方案及结果见表6，用SAS 9.2对实验数据进行回归分析，并对回归方程系数进行显著性检验，见表6。

表6 Plackett-Burman实验设计与结果

表7 回归方程系数显著性检验

由表7可知，大米粉和MgSO4的P值均小于0.01，表明高度显著。KH2PO4的P＜0.05，表明显著，确定这3个因素为影响γ-氨基丁酸的显著因素。由t值检验可知，大米粉含量，MgSO4含量为负效应，在后续的实验中应该降低大米粉和MgSO4含量。KH2PO4含量为正效应，在后续的实验中应该增加其含量。非显著性因子中，(NH4)2SO4、CaCl2为负效应，在后续的试验中应该取低水平，而谷氨酸钠为正效应，在后续的试验中应该取高水平。

2.3 最陡爬坡实验

在确定发酵培养基(NH4)2SO40.2%，CaCl20.25%，谷氨酸钠0.45%后，选定大米粉、MgSO4和KH2PO4三个关键因素进行最陡爬坡实验，试验设计及结果见表8。由表8可知，γ-氨基丁酸的产量随着关键因素的变化而变化，产量最高值出现在第2组，达到0.416 mg/g，说明此时大米粉、MgSO4、KH2PO4的浓度接近最优，故选择第2组作为中心点，进一步对培养基进行优化。

表8 最陡爬坡实验设计及结果

2.4 Box-Behnke试验设计筛选重要因素的最优水平

由最陡爬坡实验可知，以表8中实验2的条件为中心点，利用SAS软件设计Box-Behnken响应面实验。因素及水平表见表9，实验设计及结果见表10。

表9 响应面分析实验因素水平表

表10 实验设计及结果

以γ-氨基丁酸含量为响应值，运用SAS软件对表10中的实验结果结果进行二次回归分析，得到方程为Y=0.413 667+0.011 25X1+0.003 25X2－0.004 75X3－0.020 833－0.007X1X2+0.004X1X3－0.015 333+0.001 5X2X3－0.028 333。回归方程的方差分析及模拟可信度分析结果见表11。

由表11方差分析可以看出，该模型极显著［(Pr＞F)=0.003］，在模型各参数中，X1对γ-氨基丁酸产量有较显著的影响，即大米粉是对实验结果影响较大的因子，，对γ-氨基丁酸产量的影响也达极显著水平，说明MgSO4、KH2PO4对γ-氨基丁酸产量的影响是二次关系。该模型相关系数R2=0.968 7，修正决定系数=0.912 4，表明该模型预测值和实测值拟合良好，可以很好地解释响应值的变化。变化系数CV=1.684 856，表示实验数据可靠，分析结果可信。

表11 回归方程的方差分析

2.5 响应面分析及培养成分确定

用SAS软件对回归模型进行响应面分析，得到各响应面立体分析图，见图1～图3。由图及软件分析可知，回归方程存在稳定点，通过岭峪分析知X1，X2，X3的编码值分别为 0.256 36，0.044 304，－0.064 55，即大米粉总基质的含量为38.6%，MgSO4为0.23%，KH2PO4为0.37%，此条件下预测得到的γ-氨基丁酸的产量为0.419 mg/g。

2.6 验证实验

为检验响应面法回归方程预测是否可靠，采用上述最佳条件进行发酵培养。总基质为20g，大米粉占总基质的含量为38.6%，即大米粉为7.72 g，豆渣为12.28 g。MgSO4为0.23%，KH2PO4为0.37%，所得γ-氨基丁酸的产量为0.417 mg/g，与方程预测值相比，相对误差在1%以内。这表明响应面法拟合的回归方程可以用于预测实际的γ-氨基丁酸产量。

图1 Y=f(X1，X2)响应面立体分析图

3 结论

图3 Y=f(X1，X3)响应面立体图

本文分别研究了基质配比、pH值、初始含水量、温度对发酵的影响，并采用响应面实验设计方法对发酵培养基进行了优化，通过Plaekett-Burman设计从影响红曲霉产γ-氨基丁酸培养基中筛选出了大米粉、Mg-SO4、KH2PO4三个重要因素，Box-Behnke试验设计实现了条件的优化。最终得到红曲霉固态发酵产γ-氨基丁酸的最佳培养基组成和培养条件为:基质豆渣12.28g，大米粉为 7.72g，(NH4)2SO40.2%，MgSO40.23%，KH2PO40.37%，CaCl20.25%，谷氨酸钠0.45%(均占固体基质的质量分数)，初始含水量60%，初始pH值5.5，温度32℃。在优化条件下，γ-氨基丁酸产量达到0.417 mg/g，比优化前提高了13.4%。

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