糖蜜原料培养高核酸酵母NY－1培养条件优化

2012-01-12王媛媛曹春红杨旭肖冬光

食品与发酵工业 2012年1期

王媛媛，曹春红，杨旭，肖冬光

(天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津，300457)

核苷酸类物质及其衍生物是遗传工程、医药、食品、农业生产和科研领域十分重要的生化试剂和原料［1］，核苷酸几乎在所有的细胞结构、代谢、能量和调节功能等方面起着重要作用［2］。Uauy表明［3］将核苷酸添加到以牛奶为基础的代乳品中，对婴幼儿的胃肠道发育、胃肠道健康的维持以及血浆脂蛋白的组成都有有利的影响，Brunser［4］研究结果表明外源核苷酸能减少婴儿腹泻的发生。从全球来看，核苷酸供不应求，是很有发展潜力的项目。

核酸酵母是工业上制取核酸的常用材料［5－6］，目前核酸酵母的培养多数采用以糖蜜为碳源的培养基，糖蜜内除了含有大量可发酵糖(主要是蔗糖)外，还含有丰富的矿物质与维生素，是培养酵母较好的碳源。工业生产中核酸酵母菌体培养浓度偏低，大多在10g/L左右，主要原因是核酸酵母只有在对数期收获才可得到较高核酸含量，延长培养时间提高细胞浓度，往往不能保证在对数生长期收获菌体，致使菌体细胞内的核酸含量下降。本研究通过对糖蜜原料处理工艺及对核酸酵母的培养条件进行优化，旨在延长酵母生长的对数期，在保证高核酸含量的同时，提高酵母细胞浓度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

高核酸酵母NY-1(High nuclear Saccharomyces NY-1)天津科技大学微生物菌种中心保藏。

1.1.2 实验材料

工业糖蜜;尿素，NaCl、ZnSO4、FeSO4、MgSO4、KH2PO4，等均为化学纯试剂;琼脂、酵母浸粉为生化试剂。

1.1.3 实验仪器

UV757型紫外光栅分光光度计、752N可见分光光度计，上海精科上海分析仪器厂;GHP-9050生化培养箱，上海精密仪器厂;HH-2数显温控水浴锅，苏州学森仪器设备有限公司;TDZ5-WS高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.1.4 液体发酵培养基

总糖 40 g/L，MgSO41.2 g/L，尿素 1.2 g/L，(NH4)2SO40.3 g/L，ZnSO40.15 g/L，无水 FeSO40.15 g/L，NaCl0.1 g/L，H3PO41.8 mL，用氨水调节至pH 5.0。

1.2 方法

1.2.1 酵母泥RNA含量测定［7］

吸取4 mL发酵液于4 000r/min、10 min离心，弃上清液，称菌体湿重;用生理盐水洗涤菌体2次，再加入2 mL生理盐水振荡均匀，再加入2 mL 10%的高氯酸溶液，摇匀，于70℃水浴锅保温20 min(每5 min振摇1次);再于10 000 r/min、5 min条件下离心。将上清液稀释50倍后于紫外分光光度计260 nm处测光密度OD值，计算干菌内含RNA的质量分数(%)。

空气开关属于一种电器元件，其存在优势的同时也存在着一定的缺点，也并不是在任何条件下都能将其自身的优势发挥出来。笔者在多年的实践工作中发现使用空气开关保护变压器时，如果变压器的输出端出现短路的现象，空气开关将不能起到保护的作用。因此为了能够将此类问题解决，应从空气开关的自身工作原理与变压器的工作参数和结构角度出发，分析其不能对变压器起到保护作用的因素。[1]

1.2.2 发酵液菌体干重的测定

取定量发酵液离心洗涤2次，将湿菌体于105℃烘干箱内烘干至恒重。

1.2.3 残余还原糖测定方法

取发酵液样品，离心，将上清液用斐林滴定法测定。

1.2.4 总糖的测定方法［8］

用4 mol/L的盐酸将待测样品在68℃水浴下进行水解，待温度达到68℃开始计时10 min，间断摇匀，冷却后，用NaOH溶液中和至中性并定容至100mL，然后用斐林滴定法测定。

1.2.5 糖蜜原料的处理工艺优化

1.2.5.1 糖蜜初始处理条件［9］

1.2.5.2 糖蜜优化处理条件

方案1:用浓H2SO4调节至pH 3.8，在电炉上煮沸1 h。

方案2:用浓H2SO4调节至pH 4.0，在电炉上煮沸1 h。

方案3:用浓H2SO4调节至pH 4.0，在电炉上煮沸1.5 h。

冷却后将3个样品进行离心，取上清分别进行还原糖及总糖测定。

2 结果分析

2.1 氮源优化

在以糖蜜为碳源的液体发酵培养基中，添加5种不同的氮源，(NH4)2SO4、尿素、酵母粉3种单一氮源及(NH4)2SO4与酵母粉、尿素与酵母粉2种复合氮源分别进行发酵培养，选出最适合酵母生长的氮源。

2.1.1 氮源种类的选择

氮源总添加量与1.1.4中氮源的添加量相同，其中，酵母粉以含氮量12%，菌体利用率50%计算。

图1 氮源种类选择实验结果

由图1知，添加了酵母粉的实验组在菌体干重、发酵液中RNA含量及RNA理论产量上都明显优于其他实验组，但是由于酵母粉的价格较高，因此应选择酵母粉和尿素的复合氮源培养该菌，并在此基础上优化酵母粉和尿素的添加比例，以在提高酵母产量的同时尽可能减少酵母粉用量，从而降低生产成本。

2.1.2 复合氮源比例的选择

图2 复合氮源最适添加量的优化选择

总氮源添加量相同的前提下，将酵母粉与尿素以不同比例混合添加，接种高核酸酵母菌株进行液态发酵，结果见图2。由图2可以看出，随着酵母粉添加量的增加，菌体的干重和RNA含量都有所提高，但提高幅度都不是很明显，从节约成本考虑，采用酵母粉添加量为2 g/L，尿素添加量为2.5 g/L。

2.2 培养基初始pH值优化

图3 培养基初始pH值优化结果

由图3可以看出初始pH 5.0的实验组，其RNA理论产量最高，菌体干重也相对较高，因此选取培养基的初始pH值为pH5.0。

2.3 投糖浓度对NY-1生长的影响

图4所示为3种糖浓度下酵母的生长曲线，从图4可以看出，该菌在3种投糖浓度下生长时均在6h进入减速生长期，且菌体生物量没有显著差别，糖浓度为40、50和60g/L时，菌体浓度分别为8.72、8.34和8.66g/L。投糖浓度越高，酵母对糖的利用率就越低，说明培养基中的糖未得到有效利用。

图4 三种投糖浓度下菌体的生长曲线

糖浓度为60 g/L时发酵过程中发酵液总糖和还原糖的变化情况见表1。从表1看，发酵至6 h时，发酵液中还原糖的含量降至6.95 g/L，糖浓度较低可能是酵母进入减数生长期的原因之一。另一方面，发酵至6 h时的总糖浓度为25.1 g/L，糖蜜中的蔗糖基本上没有水解，这说明该菌体的蔗糖酶活性偏低，对蔗糖的利用速率较慢。因此要延长菌体生长的对数期，应先从糖蜜的预处理方法上着手，即提高糖蜜处理完后总糖的水解率。

表1 投糖60 g/L时发酵过程中发酵液总糖和还原糖的变化情况

2.4 糖蜜处理工艺优化

2.4.1 不同糖蜜处理方法下总糖的水解情况

表2为不同糖蜜处理工艺下总糖的水解情况，由表2知，加热时间相同，酸度越低，蔗糖水解率越高;酸度相同，加热时间越长，蔗糖水解率越高。本实验中总糖水解率最高的糖蜜处理条件为方案3，即用H2SO4调节至pH4.0，煮沸1.5 h，此时总糖的水解率可达到75%。

表2 不同糖蜜处理方法下总糖水解情况

2.4.2 提高糖蜜水解率前后菌体培养结果

图5为提高糖蜜水解率后菌体的生长曲线，从图5看，提高糖蜜水解率后，相同投糖浓度(60 g/L)，菌体生长的对数期被延长大约3 h，菌体浓度提高约25%。表3为提高糖蜜水解率后发酵过程中总糖与还原糖的情况，从表3看，发酵至6 h时还原糖含量为12.4 g/L，明显高于提高水解率前的糖浓度;发酵至9 h时，发酵液中还原糖含量下降至6.5 g/L，与未处理糖蜜时发酵6 h时还原糖浓度相当，酵母进入减速生长期，说明提高糖蜜中总糖的水解率后可以延长酵母对数生长期，提高糖的利用率。