响应面法优化Vc二步发酵新菌系产2-酮基-L-古龙酸的培养基

徐婷婷，高明，吕淑霞*，于晓丹，张忠泽，陈宏权

(1.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866;2.中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳110016;3.东北制药总厂Vc公司，辽宁沈阳110028)

维生素C又称L-抗坏血酸(L-Ascorbic Acid)，作为人体必需的维生素及抗氧化类物质，受到人们普遍关注，广泛应用于食品、医药、农产品开发等多个领域，需求量与日俱增［1］。上世纪70年代我国学者尹光琳发明了“二步发酵法”生产Vc［2］，该方法工艺简单、成本低、“三废”少，已成为我国Vc工业生产的主要方法［3］。其中第2步将L-山梨糖转化为Vc前体2-酮基-L-古龙酸，由产酸菌—氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和伴生菌—巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)共同完成。产酸菌单独生长和传代困难，对伴生菌依赖性较强。目前已知具有伴生能力的菌属有芽胞杆菌、假单胞菌、欧文氏菌、微球菌、荧光杆菌、变形菌、肠杆菌和酵母菌［4］等，但由于伴生能力较差，促产酸不稳定，菌株易污染等多方面因素，生产中常用的依然是巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)，菌种较单一。本文以短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)HJ-04作为伴生菌与产酸菌搭配，发现其能更好地促进产酸菌生长及产酸，经响应面优化［5］后新菌系的产酸量进一步提高，产酸周期缩短，具有良好的科研价值及应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)B2980和氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)，由东北制药总厂提供。短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)HJ-04由沈阳农业大学生化实验室提供。1.1.2培养基(g/L)①种子培养基:山梨糖20，葡萄糖2，尿素1，玉米浆5，CaCO31，用H2O定容到1 L;pH 6.7，121℃灭菌30 min;②发酵培养基:优化前:山梨糖80(单独灭菌)，尿素12，玉米浆10，KH2PO41，MgSO40.2，CaCO35，用H2O定容到1 L;pH 6.7，121℃灭菌30 min。优化后:山梨糖94.95(单独灭菌)，尿素11.99，玉米浆14.13，KH2PO41，MgSO40.2，CaCO35，用H2O定容到1 L;pH 6.7，121℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养①混合菌种子培养:150 mL三角瓶装液量20 mL，向混合菌斜面中加入少量无菌水，刮下菌苔并混匀。吸取1 mL菌液接种到种子培养基中，29℃、180 r/min振荡培养24 h;②混合菌发酵培养:150 mL三角瓶装液量10 mL，吸取1 mL产酸菌种子培养液接种到发酵培养基中，29℃、180 r/min振荡培养48 h。

1.2.2 2-KGA含量的测定取2 mL发酵液于试管中，加入2 mL 7 mol/L H2SO4，100℃煮沸30 min。冷却后以1%淀粉作指示剂，用0.05 mol/L I2溶液滴定至蓝色为反应终点。按以下公式计算2-KGA生成量。

其中，M为I2溶液浓度(0.05 mol/L×2);V为I2溶液消耗体积(mL);A为2-KGA转化为Vc的转化率(%)(以63.1%计算);B为所取发酵液体积(mL);0.907 2为Vc分子量/2-KGA分子量;0.088 06为1 mL I2溶液相当于8.806 mg Vc［6］。

1.2.3 响应面分析使用Design-Expert软件进行响应面设计及分析［7-8］。

1.2.4 试验设计①单因素试验设计:其他因素不变，对发酵培养基主要营养物质L-山梨糖、尿素、玉米浆、碳酸钙分别设计5水平的单因素试验，接种后，28℃，180 r/min摇床培养48 h，每组重复3次，测定2-KGA含量，并计算糖酸转化率，分析各因素对混菌发酵产酸的影响;②Plackett-Burman试验设计:除碳源、氮源外，混菌生长产酸还需要多种无机盐及生长因子，利用Plackett-Burman试验可有效筛选对产酸影响显著的因素，进行响应面优化。根据文献记载［9-10］，选择L-山梨糖、尿素、玉米浆、KH2PO4、MgSO4、CaCO36个因素作为考察对象，设计12组的Plackett-Burman试验，接种后，28℃，180 r/min摇床培养48 h，测定2-KGA含量，重复3次，分析数据筛选显著影响因子，各因素水平选择见表1;③响应面试验设计:筛选出显著影响因子后，以L-山梨糖、尿素、玉米浆浓度为自变量，2-KGA产量为响应值，采用Box-Behnken设计法设计3因素3水平的17组试验。根据单因素试验结果，以产酸量最大值对应的各因素浓度作为自变量中心点，利用公式xi=(Xi-X0)/ΔX对自变量进行编码，其中xi为自变量编码值，Xi为自变量真实值，X0为中心点处自变量真实值，ΔX为自变量变化步长，编码水平见表2。发酵液接种后，28℃，180 r/min摇床培养48 h，测定2-KGA含量，重复3次，进行响应面分析。

表1 Plackett-Burman试验因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken试验因素水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 不同伴生菌对产酸菌产酸的影响

以实验室筛选的短小芽胞杆菌HJ-04和工业生产用菌株巨大芽胞杆菌B2980作为伴生菌分别与氧化葡萄糖酸杆菌搭配，测定发酵产2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KGA)量随时间变化(图1)。结果显示，HJ-04与B2980相比能够更好的促进产酸菌产酸，产酸量提高26%，产酸终点提前12 h，具有重要应用价值，为进一步提高2-KGA产量，对新组合菌系发酵培养基进行优化。

图1 不同伴生菌对产酸菌产酸的影响Fig.1 Effect of different strains on

2.2 发酵培养基的单因素分析

单因素试验结果显示，作为发酵培养基中的主要碳源及产酸菌产酸的底物，增加L-山梨糖浓度可增大2-KGA产量，但转化率相应降低，发酵终点延后，发酵成本增加，且高浓度L-山梨糖抑制2-KGA的合成［11］(图2)。

尿素作为培养基中的氮源及pH调节剂参与菌体的生长及代谢，随尿素浓度的增加产酸量呈现先升后降的趋势，尿素浓度过高，明显抑制产酸(图3)。

图2 L-山梨糖浓度对新菌系产酸的影响Fig.2 Effect of L-sorbose concentration on

图3 尿素浓度对新菌系产酸的影响Fig.3 Effect of urea concentration on

图4 玉米浆浓度对新菌系产酸的影响Fig.4 Effect of corn steep liquor concentration on

玉米浆含有菌体生长所需的氨基酸、微量元素和天然物质，是产酸菌生长和产酸不可缺少的组分［12］。随玉米浆浓度的增加产酸量上升，达到一定浓度后受其他营养物质限制积累量不再提高(图4)。

已知伴生菌适合在偏碱性环境下生长，CaCO3的主要作用是中和发酵过程中产生的酸，避免pH过低抑制伴生菌生长进而影响产酸菌生长与产酸，适量的碳酸钙能够促进混合菌系发酵产酸(图5)。

图5 碳酸钙浓度对新菌系产酸的影响Fig.5 Effect of CaCO3concentration on

2.3 显著影响因子的筛选

Plackett-Burman试验设计及结果见表3。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果Table 3 Design and result of Plackett-Burman

对试验结果进行分析，各因素正负效应及显著性评价见表4，数据表明:在所选水平中，L-山梨糖、尿素、玉米浆为正效应因素，增大其浓度促进产酸，KH2PO4、MgSO4、CaCO3为负效应因素，浓度过高抑制产酸。依据显著性判断标准(P＜0.05)，L-山梨糖、尿素、玉米浆均为显著影响因子，因此选择此3因素进行响应面优化。

表4 各因素效应及显著性Table 4 Stdized effects and p-value

2.4 发酵培养基的响应面优化

2.4.1 Box-Behnken试验3因素3水平17组的Box-Behnken试验设计及结果见表5，其中12组试验为析因点，自变量取值在x1、x2、x3所构成的三维顶点，其余5组试验为零点，自变量取中心点，用以估计试验误差。

表5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Design and result of Box-Behnken design

2.4.2 回归方程的方差分析对Box-Behnken

试验结果进行二次多项回归拟合，得到回归方程:

转化为真实值得到方程:Y=-369.621 25

其中Y为2-KGA产量预测响应值，x1、x2、x3为L-山梨糖、尿素、玉米浆编码值，X1、X2、X3为L-山梨糖、尿素、玉米浆真实值。

对回归模型方程(1)进行方差分析(表6)可知:二次回归模型极显著(P＜0.000 1)。失拟项F=2.44，P=0.204 8＞0.1，失拟项不显著，说明模型与试验不相符的概率较低，模型可信。模型相关系数R2=0.978 9，说明预测值与真实值之间有良好的拟合度，信噪比为16.192(＞4)，模型可用于预测。

分析模型一次项、二次项、交互项可知:一次项x1、x2、x3和二次项、、对产酸量影响均显著(P＜0.05);交互项中，x1x3最为显著，x1x2次之，x2x3不显著，说明L-山梨糖与玉米浆、L-山梨糖与尿素对产酸量均会产生交互影响，尿素与玉米浆交互作用较小。

2.4.3 响应面交互作用及优化固定3因素之一在中心点，根据方程(2)做另外2因素对2-KGA产量的响应曲面图(图6～8)。由图可见，各因素曲面坡度均较陡，说明L-山梨糖、尿素、玉米浆对2-KGA产量影响显著，且产酸量都呈先升后降趋势，与单因素试验结果一致。L-山梨糖与尿素对2-KGA产量的交互影响如图6所示。尿素浓度较低时增加L-山梨糖浓度对2-KGA产量影响较小，产酸量较低，说明尿素供应不足严重抑制产酸，尿素浓度达到11 g/L以上，L-山梨糖方向曲面变陡，此时碳源及底物成为影响产酸的关键因素，且随L-山梨糖浓度增大，高浓度尿素对产酸的抑制作用减弱。固定尿素浓度在中心点，考察L-山梨糖与玉米浆的交互作用(图7)可知:L-山梨糖与玉米浆均处于较低浓度时，对产酸抑制明显，此时增加二者任一浓度都可有效提高2-KGA产量，推测二者含有混菌产酸所必须的类似营养物质;当玉米浆浓度小于14 g/L时，增加L-山梨糖浓度可持续提高产酸量，玉米浆浓度达到14 g/L以上，高浓度L-山梨糖对产酸呈现抑制作用，即高浓度L-山梨糖与高浓度玉米浆共同抑制产酸。

尿素与玉米浆交互作用对2-KGA产量的影响见图8。图中曲面较规则，等高线中心近似圆形，交互作用不明显。

曲面图均有最高点，求导方程(2)可知响应值存在极值点，此时L-山梨糖、尿素、玉米浆浓度分别为94.95、11.99、14.13 g/L，极值点处2-KGA预测产量为75.742 3 g/L。

2.5 优化结果验证

采用响应面优化后的培养基(L-山梨糖94.95 g/L、尿素11.99 g/L、玉米浆14.13 g/L、KH2PO41 g、MgSO40.2 g、CaCO35 g)进行摇瓶发酵，重复3次，测定2-KGA含量随时间变化曲线(图9)，48 h达产酸终点，2-KGA平均产量76.9 mg/mL，与模型预测结果基本一致。相比优化前2-KGA产量提高12.31 mg/mL，产酸终点提前，产酸周期缩短约6 h，原料利用率提高，节约了发酵时间及成本。

图9 优化前后新菌系2-KGA产量随时间变化曲线Fig.9 Time-course of 2-keto-L-gulonic acid production of new strains before and after optimization

3 讨论

以短小芽胞杆菌HJ-04作为Vc二步发酵中的伴生菌，国内外未见报道，丰富了伴生菌菌种资源。HJ-04促进产酸菌产酸的能力明显强于工业生产用菌株—巨大芽胞杆菌B2980，经响应面优化后，新组合菌系产酸量进一步提高，产酸周期缩短，具有广阔应用前景。

多种因素相互作用对混菌发酵产酸会产生不同程度的影响，考察单因素对产酸的影响缺乏交互信息，响应面法可精确考察各因素对响应值的综合作用。作为发酵培养基中的主要碳源及产酸菌产酸的底物，L-山梨糖浓度对2-KGA产量影响显著;尿素作为培养基中的无机氮源及pH调节剂，供应不足严重影响产酸;玉米浆含有菌体生长所需的多种天然物质，是产酸菌生长和产酸不可缺少的组分;CaCO3通过调节发酵液pH影响产酸。L-山梨糖、尿素、玉米浆是影响产酸的显著因素，对2-KGA合成有交互作用:增加L-山梨糖浓度可减弱高浓度尿素对产酸的抑制，高浓度L-山梨糖与高浓度玉米浆共同抑制产酸。响应面优化后确定L-山梨糖、尿素、玉米浆最佳浓度分别为94.95、11.99、14.13 g/L，48 h发酵终点2-KGA产量达到76.9 mg/mL，与预测吻合，模型可靠。

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