微渗析技术用于金黄膏在大鼠体内经皮渗透性的初步研究*

张 倩，尹忠鹏，赵海南，庞晓晨，马 丽，郭 林，刘志东，王 红

微渗析技术用于金黄膏在大鼠体内经皮渗透性的初步研究*

张 倩，尹忠鹏，赵海南，庞晓晨，马 丽，郭 林，刘志东，王 红

[目的]研究金黄膏在大鼠体内的经皮渗透性。[方法]应用经皮微渗析在体取样技术，以Wistar大鼠为模型动物进行实验。微渗析探针的在体回收率采用反向渗析法测定。[结果]反向渗析法测定的在体回收率为（32．81±1．33）%。渗析液中的药物稳态流量（Js）为2．73 ng/h，滞后时间（Tlag）为1．50 h。[结论]金黄膏中的有效成分在皮肤内有一定的滞留量，该制剂适合经皮给药。

经皮微渗析；盐酸小檗碱；经皮吸收；高效液相色谱法

将微渗析在体取样技术应用于药物的经皮吸收研究中，称之为经皮微渗析（cutaneous microdialysis）[1-4]。此技术直到 1991年 Anderson等[5]对微渗析探针进行改进，并研究了人体对乙醇的经皮吸收，才开始了真正意义上的经皮微渗析，此后这项技术发展非常迅速，为该领域的研究提供了一种新方法。对实验动物皮肤组织进行在体、连续的药物浓度监测，是经皮微渗析技术的重要特点，为在体研究外用制剂的经皮吸收动力学和生物等效性提供了有效的方法，微渗析技术在透皮给药方面已得到广泛应用。

金黄膏是一种良好的治疗疮毒红肿疼痛等疾病的中药复方膏剂，外敷能达到清热除湿、解毒消肿、散瘀止痛的效果[6]。其主要由姜黄、白芷、大黄、黄柏、天南星、厚朴、陈皮等10味中药组成。由于小檗碱为该膏剂主药黄柏中含量较高的成分，含量可达总生物碱的85%以上[7]，故本实验以小檗碱为检测指标来研究药物在动物体内动态变化的规律及特点。

1 材料与仪器

金黄膏（由天津中医药大学第二附属医院制剂室提供）；盐酸小檗碱标准品（中国药品生物制品检定所，批号110713-200609）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色谱纯）；磷酸二氢钾（天津市光复科技发展有限公司，分析纯）；磷酸（天津市北方天医化学试剂厂，分析纯）；乌拉坦（天津市光复精细化工研究所，分析纯）。Wistar大鼠,雌雄兼用，体质量200~250 g，天津实验动物中心提供，合格证号：SCXK（津）2010-0002。CMA-102型微量泵控制器（CMA公司，瑞典）；LM-10线型微渗析探针（Bioanalytical systems，美国）；SPD-10Avp岛津高效液相色谱仪（日本Shmadzu公司）；AX205电子天平（瑞士Mettleb Toledo公司）；BP121S电子天平（德国Sartorius公司）。

2 实验方法

2.1 色谱条件 参照文献[8]，采用高效液相色谱法（HPLC）测定。色谱柱为Diamond DIKMA ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈：磷酸盐缓冲液（5%磷酸调 pH 至3.0）=30∶70，流速为 1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为346 nm，进样量20 μL。

2.2 探针的植入 取Wistar大鼠，用20%乌拉坦腹腔注射麻醉（5 mL/kg，腹腔注射），剃除腹部鼠毛，仰位固定于鼠板上。将探针植入大鼠真皮中，渗析窗置于所要采样的部位。用组织胶将探针入口及出口位置固定。大鼠周围环境温度控制在37~39℃[9]。

2.3 在体回收率的测定 微渗析探针植入大鼠体内后，用去离子水作为灌注液，冲洗探针1.5 h。在1.5 h的冲洗期内，由于探针的植入而引起的皮肤局部充血、红肿和皮肤短期增厚可以消除或减少。有文献[10]报道在无毛大鼠活体皮肤内植入微渗析探针30 min后，皮肤血流以及组胺水平即可以恢复到正常值，因此主张微渗析实验至少在探针植入30 min后才能开始进行。

冲洗期过后，依次用 414、621、828、1 040、2 070 ng/mL的盐酸小檗碱溶液为灌注液，流速设定为5.0 μL/min，更换灌注液后，在收集下一个样品之前，至少有1 h的冲洗期。每间隔30 min收集1次进样，取2次平均值。以渗析液和灌注液中药物的浓度差为纵坐标，对灌注液中药物浓度作图，所得直线的斜率即为探针的回收率。直线的斜率以最小2乘法求得。

2.4 金黄膏大鼠在体经皮微渗析实验 冲洗期过后，将金黄膏样品约3 cm2，贴于大鼠腹部剪毛区，使得探针的渗析窗刚好位于贴片的正下方，给药9h。于 0~1、1~2、2~3、3~4、4~5、5~6、6~7、7~8、8~9 h 间收集渗析液样品，注入HPLC系统进行测定。

3 结果与讨论

3.1 在体回收率的测定 参照文献[11]，微渗析探针中灌注液的连续流动导致了药物在组织液和灌注液之间的扩散不能完全达到平衡，药物在渗析液中的浓度和在组织液中的浓度并不相等。相对回收率是指在渗析液中的浓度（Cd）和在组织液中的浓度（Cm）的比值，其定义式为：

以Cd-Cp对Cp作图，所得直线的斜率即为探针的回收率R，横轴上的截距为Cm。

根据相对回收率的定义式，以渗析液与灌注液中小檗碱的浓度差（Cd-Cp）对灌注液中的药物浓度（Cp）作图，得到线性方程:Cd-Cp=-0.328 1Cp-45.759（r=0.992 5），表明有良好的线性关系，该方程计算的回收率为（32.81±1.33）%。

3.2 在体经皮微渗析实验 以金黄膏连续给药9 h，测定渗析液中药物浓度，图1是以渗析液中药物的

式中Cp为灌注液中的药物浓度。如果Cp=0，即渗析探针中灌注的是空白人工生理溶液 (灌注液)，则公式-1可以改写为：浓度对取样时间间隔的中间点作图得到的图线，图2是渗析液中药物的累积量对时间作图得到的图线，对图线中的直线部分进行回归,得到Q-t方程：Q＝2．7323t－1．505 6（r＝0．999 6），直线的斜率为渗析液中的药物透皮吸收的稳态流量（Js），即2.73 ng/h；直线与时间轴的交点为滞后时间（Tlag），即1.50 h。

以上药物的浓度-时间曲线是在时间上连续的药物浓度监测图，真实的记录了药物浓度在整个监测时间范围内的连续变化波动情况。药物的累积透过量时间曲线也表明了药物在皮肤内有一定的滞留量。在实验过程中，渗析液中测得的药物实际上是在一定的取样时间段内的蓄积量，即最终测得的浓度为取样时间段内的平均浓度。

微渗析技术对组织中药物的连续的、不间断的监测，使实验数据更接近真实值，更加具有说服力，为评价药物疗效提供了十分重要的实验数据。

[1] Ault JM,Lunte CE,Meltzer NM,et al.Microdialysis sampling for the investigation of dermal transport[J].Pharm Res,1992,9(10):1256-1261.

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[3] Matsuyama K,Nakashima M,Ichikawa M,et al.In vivo microdialysis for the transdermal absorption of valproate in rats[J].Biol Pharm Bull,1994,17(10):1395-1398.

[4] Benfeldt E,Serup PJ,Menne T.Effect of barrier perturbation on cutaneous salicylic acid in human skin:in vivo pharmacokinetics using microdialysis and non-invasive quantification of barrier function[J].Br J Dermatol,1999,140(4):739-748.

[5] Anderson C,Andersson T,Molander M.Ethanol absorption across human skin measured by in vivo microdialysis technique[J].Acta Derm Venereol,1991,71(5):389-393.

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[8] 罗懿妮，赖宇红，薛巧如，等．盐酸小檗碱RP-HPLC测定条件的比较[J].中药材，2004，27（9）：647－649．

[9] 丁平田，徐 晖，卞生杰，等．以经皮微渗析技术研究奥旦西酮的大鼠在体经皮吸收[J].药学学报，2000，35（4）：305－308．

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[11]de Lange EC,de Boer AG,Breimer DD.Methodological issues in microdialysis sampling for pharmacokinetic studies[J].Adv Drug Deliv Rev,2000,45(2):125-148.

Preliminary study on permeability of Jinhuanggao by transcutaneous microdialysis in rats in vitro

ZHANG Qian1,YIN Zhong-peng1,ZHAO Hai-nan1,PANG Xiao-chen1,MA Li1,GUO Lin2,LIU Zhi-dong1,WANG Hong2
（1．Tianjin Modern Chinese Medicine Key Laboratory-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base,Tianjin 300193,China;2.Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300150,China）

[Objective]To study the transcutaneous absorption of Jinhuanggao in rats.[Methods]An in vivo sampling technique and transcutaneous microdialysis were used to determine the drug concentration in dermis in rats.The recovery of the microdialysis probe was adopted to assess in vivo according to the retrodialysis method.[Results]The recovery in vivo was (32.81±1.33)%by retrodialysis method.The steady state flux of berberine hydrochloride in dialysate was 2.73 ng/h,and the lag time was 1.5 h.[Conclusion]The active ingredient in Jinhuanggao has a good retention amount under the skin.So this preparation is suitable for transdermal drug delivery.

cutaneous microdialysis;berberine hydrochloride;transdermal delivery;HPLC

R284

A

1673－9043（2012）03－0151-03

国家自然基金项目（81072818）。

300193 天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地（张 倩，尹忠鹏，赵海南，庞晓晨，马 丽，刘志东）300150 天津中医药大学第二附属医院（郭 林，王 红）

张 倩（1987-），女，硕士研究生，主要从事缓控释制剂的研究。

*通讯作者：刘志东，王 红。

2012-05-13）