育泡饮对大鼠卵巢颗粒细胞间隙连接蛋白43表达及分泌功能的影响*

金 哲，李 楠，刘艳霞

育泡饮对大鼠卵巢颗粒细胞间隙连接蛋白43表达及分泌功能的影响*

金 哲，李 楠，刘艳霞

[目的]观察育泡饮对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞（GC）间隙连接蛋白43（CX43）表达及雌二醇（E2）分泌的影响，探索中药促进卵泡发育的可能作用机制。[方法]制备大鼠卵巢颗粒细胞进行原代培养，细胞培养48 h后，加入促卵泡激素（FSH）50 ng/mL和不同剂量的育泡饮，继续培养48 h，放免法测定颗粒细胞培养液中E2的含量，Western blot法检测CX43蛋白的表达。[结果]1）育泡饮能够促进卵巢颗粒细胞分泌E2，随着药物浓度的增大，E2分泌逐渐增加。2）育泡饮可明显促进颗粒细胞CX43蛋白的表达，其中高剂量组的促进作用与FSH组作用相似。[结论]育泡饮能明显促进卵巢颗粒细胞CX43蛋白的表达及E2分泌，说明育泡饮可通过上调CX43蛋白的表达促进颗粒细胞的增殖，增强颗粒细胞的抗凋亡能力，进而调节卵泡的发育。

育泡饮；卵巢颗粒细胞；间隙连接蛋白43；雌二醇；实验研究

据统计，育龄夫妇中不孕症的发生率为10%～15%[1]，其中以女性排卵障碍因素为主因的占20%～40%[2]。因此，深入研究卵泡发育成熟、排出的机制对提高生殖健康水平具有重要的意义。目前，排卵障碍的治疗手段已形成完整体系，针对排卵障碍采取的诱发排卵治疗，在临床应用中取得了显著的疗效。然而用药安全性，成为在辅助生殖领域进一步应用的瓶颈。近年来，随着中医药现代研究的不断深入，中药在促卵泡发育，调节卵巢功能方面的研究硕果累累，但其机制尚待明确。基于此，以卵巢颗粒细胞为切入点，观察中药育泡饮对颗粒细胞分泌及间隙连接蛋白43（CX43）表达的影响，旨在从分子水平探索育泡饮促进卵泡发育，调节卵巢功能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 23~25日龄未成年雌性大鼠10只，体质量（50±10）g，购自中国医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK（京）2009-0007。

1.1.2 实验药物 中药育泡饮：主要成分由紫河车、菟丝子、熟地黄、党参、当归等10味药物组成，购自北京同仁堂股份有限公司。育泡饮水提醇沉液由北京中医药大学东方医院制剂室完成，制备为1 g/mL浓度的药液，4℃冰箱保存。注射用重组人促卵泡激素（FSH75IU/支默克雪兰诺公司，批号：Y15A8530）。

1.1.3 主要试剂和仪器 孕马血清（PMSG）（内蒙古赤峰博恩药业有限公司）。胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM/F12培养基（美国GIBCO/BRL）。荧光素FITC（美国Sigma公司）。雌二醇（E2）放免试剂盒（北京北方生物技术研究所），兔FSHR抗体（北京百事创新公司），兔抗CX43单克隆抗体（上海优宁维生物有限公司），GAPDH兔抗人单克隆抗体（SANT CRUZ公司），电化学发光免疫法（ECL）增强化学发光显色试剂盒（武汉博士德）。倒置相差显微镜（OLYMPUSIMT-2），荧光显微镜（OLYMPUS BX51），电泳及转膜设备（美国Bio-Rad公司），离心机（美国Sigma公司），CO2培养箱（美国NAPCOMODEL5410），超净工作台（北京昌平长城空气净化工程公司CJT-R-Ⅱ型），电热恒温水箱（上海实验仪器厂，HH-W 21.420型）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠卵巢颗粒细胞原代培养 参照Lovekamp等[3]介绍的方法并加以改进，雌性SD大鼠10只，每只腹壁皮下注射PMSG 40 U，48 h后脱臼处死。置于75%乙醇中浸泡5 min，在无菌条件下取出卵巢放入预冷的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，去除卵巢周围的组织及包膜，PBS清洗2遍后置于预冷的DMEM/F12培养基中。25号针头刺破卵泡，释放颗粒细胞入培养基，200目不锈钢细胞筛过滤。1 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集颗粒细胞。向沉积在离心管底的细胞团中加入DMEM/F12培养基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素），制成单细胞悬液，0.4%台盼蓝染色，血细胞计数板计数活细胞数目，细胞存活率>90%。按照不同实验要求，将细胞悬液稀释成相应的浓度。放免分析实验为：5×105个/mL，接种于24孔板。蛋白印记实验为1×106个/mL接种于6孔板。在37℃、5%CO2温箱中预培养48 h。

1.2.2 颗粒细胞的鉴定 体外培养大鼠卵巢颗粒细胞，常规细胞爬片，应用苏木-伊红（HE）染色及细胞免疫荧光法鉴定颗粒细胞。

1.2.3 细胞分组 颗粒细胞在培养48 h后换液，共分5组：正常对照组，FSH对照组，育泡饮低、中、高剂量组。正常对照组加入含1%FBS的培养液，中药组在含1%FBS的细胞培养液中分别加入不同浓度的育泡饮稀释液（低剂量组，1×10-6g/mL；中剂量组，1×10-5g/mL；高剂量组，1×10-4g/mL），西药对照组加入用1%FBS培养液稀释后的FSH 50 ng/mL。放免分析实验每组设5个复孔，蛋白印记实验每组设3个复孔。继续培养48 h。

1.2.4 培养液中E2含量的测定 用放免法测定各组颗粒细胞培养液中E2的含量。测定方法按照放免试剂盒说明书进行。批内变异系数均小于5%，批间变异系数均小于10%。

1.2.5 Western blot测定颗粒细胞CX43蛋白的表达 吸去培养板中的培养液，PBS洗涤细胞2次，弃去PBS。加入400 μL蛋白裂解液，充分裂解细胞，100℃煮沸5 min，5 000 r/min离心2 min。用Bradford方法测定蛋白浓度，配置10%的分离胶和5%的积层胶，每泳道上样50 μL，100 V电泳2 h。将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液（溶于PBS液中）室温封闭1.5 h，加入兔抗CX43蛋白单克隆一抗（1∶200）和 GAPDH 兔抗人单克隆一抗（1∶200），4℃孵育过夜，PBS溶液洗膜3次，每次15 min。加入羊抗兔 HRP 标记的二抗（1∶1 000），孵育 3 h，PBS洗膜3次，用ECL增强化学发光法显色。X光片曝光显影。采用Quantity One软件进行对特异蛋白条带进行灰度扫描和定量分析。结果判定：目的蛋白含量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

2 结果

2.1 卵巢颗粒细胞培养及形态学观察 卵巢颗粒细胞呈单层贴壁生长，培养12～24 h后细胞开始贴壁，48 h后细胞迅速增殖，生长旺盛，见图1、图2。

图1 培养24 h后大鼠卵巢颗粒细胞（×10）

图2 培养48 h后大鼠卵巢颗粒细胞（×10）

2.2 卵巢颗粒细胞的鉴定

2.2.1 HE染色 经HE染色后，在镜下观察细胞呈多角形或梭形，胞核呈卵圆形，被染成深蓝色，胞浆呈淡红色，见图3。

图3 大鼠卵巢颗粒细胞HE染色（×10）

2.2.2 FSHR表达鉴定颗粒细胞 经免疫细胞荧光染色后，在荧光显微镜下观察，结果显示颗粒细胞有FSHR阳性表达，FSHR的阳性率>90%，见图4。

图4 大鼠卵巢颗粒细胞FSHR免疫细胞荧光染色（×400）

2.3 育泡饮对各组卵巢颗粒细胞分泌E2的影响见表1。由表1可见，育泡饮各剂量组和空白组相比较差异均有统计学意义（P＜0.05），随着育泡饮药物浓度的增大，E2的分泌逐渐增加。与FSH组相比较，育泡饮低剂量组与其差异有统计学意义（P＜0.05），而育泡饮中、高剂量组与FSH组促进E2分泌的作用无明显差异。

表1 育泡饮对各组卵巢颗粒细胞分泌E2的影响（±s）

表1 育泡饮对各组卵巢颗粒细胞分泌E2的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与 FSH 组比较，#P＜0.05。

组别药物浓度孔数E2（pg/mL）空白组 - 5 175.56±19.00#FSH 组 50 ng/mL 5 320.20±65.30*育泡饮低剂量组 1×10-6g/mL 5 257.62±28.14*#育泡饮中剂量组 1×10-5g/mL 5 308.58±24.97*育泡饮高剂量组 1×10-4g/mL 5 319.88±33.10*

2.4 育泡饮对各组卵巢颗粒细胞CX43蛋白表达的影响 见图5、表2。由表2可见，与空白组相比较，育泡饮各剂量组及FSH组CX43蛋白表达均明显增加（P＜0.05）。与FSH组比较，育泡饮高剂量组

CX43蛋白的表达与之差异无统计学意义（P＞0.05）。

育泡饮中、低剂量组较之明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。而中、低剂量之间差异无统计学意义

（P＞0.05）。

表2 育泡饮对各组卵巢颗粒细胞CX43蛋白表达的影响（±s）

表2 育泡饮对各组卵巢颗粒细胞CX43蛋白表达的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与 FSH 组比较，#P＜0.05。

组别 药物浓度 孔数 CX43/GAPDH空白组 - 3 0.124±0.010#FSH 组 50 ng/mL 3 0.582±0.037*育泡饮低剂量组 1×10-6g/mL 3 0.354±0.026*#育泡饮中剂量组 1×10-5g/mL 3 0.374±0.023*#育泡饮高剂量组 1×10-4g/mL 3 0.604±0.028*

3 讨论

间隙连接是细胞之间主要的一种连接方式，具有重要的通讯功能。卵巢卵泡在整个发育过程离不开细胞间的间隙连接。目前已知，CX43是卵巢间隙连接中主要的连接蛋白，主要表达于卵泡颗粒细胞（GC）之间。GC通过间隙连接调控卵母细胞的生长、分化和成熟，进而调节卵泡的发育。Ackert等[4]研究发现，CX43-/-小鼠卵泡仅发育至卵泡初级阶段，卵母细胞及GC出现一定程度的空泡化，透明带发育不良，卵母细胞不能恢复减数分裂，不能受精。这表明在卵泡的生长和发育过程中，CX43是颗粒细胞增殖所必需的，由于CX43的缺失导致GC分层失败，将对卵泡的发育带来严重的影响。卵泡的选择与闭锁有赖于GC的凋亡，目前研究还发现，CX43的表达与颗粒细胞的凋亡指数呈负相关[5]，CX43具有抗GC凋亡的能力，在卵泡选择过程中起重要的作用。

现代研究表明，中医药在促进卵泡发育、调节卵巢功能、改善机体的内分泌紊乱、调经助孕方面有较好的疗效，但其机制尚待明确。在总结以往治疗排卵障碍性疾病经验的基础上，提出卵子属生殖之精的范畴，肾中精气的充盛是卵子发育成熟的基础，“任脉通、冲脉盛”是卵泡进一步生长成熟的条件。认为肾中精气充沛，冲任气旺血盛、运行调畅，则卵子生长、发育、排出正常，孕育有本[6-8]。以此为理论主导，应用育泡饮治疗排卵障碍性疾病。方中紫河车乃血肉有情之品，补肾益精，养血益气，培元固本；菟丝子、熟地黄补肾填精，赞化生育；党参、当归，气血双调，培补后天。诸药合用，共奏补肾填精、益气养血之效。

本实验以体外培养卵巢颗粒细胞为研究对象，从蛋白水平对育泡饮促进卵泡发育的机制进行研究，结果表明：育泡饮可促进颗粒细胞E2的分泌，随着药物浓度的增大其分泌作用逐渐增强；育泡饮还能明显促进CX43蛋白的表达，其中高剂量组的促进作用与FSH组作用相似。由此推测，育泡饮通过上调卵巢颗粒细胞CX43蛋白的表达，从而促进GC的增殖和分泌功能，增强GC的抗凋亡能力，进而调控了卵泡的发育。这可能是育泡饮影响卵泡发育、调节卵巢功能的重要分子基础之一。

[1] 黄荷凤.现代辅助生育技术[M].北京:人民军医出版社，2003:303-387.

[2] 张丽珠．临床生殖内分泌与不育症[M]．北京：科学出版社，2001：446.

[3] Love kamp TN，Davis BJ．Mono-(2-ethylhexy)phthalate suppresses aromatase transcript levels and estradiol production in cultured rat granulose cells[J]．Toxicol Appl Pharmacol，2001,172(3):217-224.

[4] Ackert CL,Gitters JEI,0’Brien MJ，et al．Intercellular communication and connexin-43 gap junctions is required for ovarian follicular genes is in the mouse[J]．Dev Biol，200l，233(1):258-270.

[5] Dmitri V,Krysko SM，Lucl，et al．Gap junction communication and connexin-43.expression in relation to apoptotic cell death and survival of granulose cells[J].Endocrinology,2004，52:1199-1207.

[6] 刘艳霞.郭志强教授分期治疗妇科病经验[J].北京中医药大学学报（中医临床版），2007，14（4）:19-21.

[7] 宋春敬，刘晓帆，孙艳明，等.滋肾调冲法对大鼠外周血内皮细胞影响的实验研究[J].天津中医药，2011，28（6）：493-495.

[8]李瑞环，王 玲，孙艳明，等.滋肾调冲法对诱发排卵大鼠卵巢血管内皮生长因子表达的影响[J].天津中医药，2008，25（2）：144-146.

Effects of Yupao Yin on expression of CX43 in ovarian granulosa cells of rats and secretion function

JIN Zhe1,LI Nan2,LIU Yan-xia1
（1.Dong Fang Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078,China;2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China）

[Objective]To assess the effects of Yupao Yin on expression of CX43 in ovarian granulosa cells(GC)of rats and secretion quantity of E2.[Methods]Granulosa cells are isolated from rats ovaries and cultured for 48 hours,followed by culture in medium system containing FSH (50 ng/mL)and different dosage of Yupao Yin for 48 hours.The expression of CX43 is measured by western blot and the secretion quantity of E2is performed by radioimmunoassay.[Result]Yupao Yin can promote secretion of E2and the secretion quantity of E2gradually increases with the increase of the dosage.Yu pao Yin can significantly stimulate the expression of CX43.Amomg them the effect of high dosage group is similar with FSH group.[Conclusion]Yupao Yin obviously promote the expression of CX43 and secretion of E2of ovarian GC of rats.It is showed that Yupao Yin can promote proliferation of GC and enhance the ability of GC anti-apoptosis through up-regulation the expression CX43.And then to promote the development of follicular.

Yupao Yin;ovarian granulosa cells;connexin43;E2;experimental study

R285.5

A

1673－9043（2012）03－0147-04

北京中医药大学中青年教师资助基金项目（2009 JYBZZ-JS090）。

100078 北京中医药大学东方医院（金 哲，刘艳霞）100029 北京中医药大学（李 楠）

金 哲（1954-），女，主任医师，教授，博士生导师，从事生殖内分泌及不孕症方面的研究与治疗。*

刘艳霞。

2012-05-12）