＊ 杀真菌素链霉菌AL－04发酵产抗生素工艺研究

李增波，杨斌，李文斌，石国亮

（1.太原科技大学 化学与生物工程学院，山西 太原 030021；2.山西省农业科学院 谷子研究所，山西 长治 046011）

＊杀真菌素链霉菌AL－04发酵产抗生素工艺研究

李增波1，杨斌2，李文斌1，石国亮1

（1.太原科技大学 化学与生物工程学院，山西 太原 030021；2.山西省农业科学院 谷子研究所，山西 长治 046011）

为了提高杀真菌素链霉菌菌株AL－04的发酵滤液对植物病原真菌的抑菌活性，采用单因素试验和均匀试验设计，对其发酵条件和培养基成分进行了研究.结果表明，菌株AL－04产抗生素的最适发酵培养基为：黄豆粉34.0 g，鱼粉12.0 g，蔗糖2.0 g，可溶性淀粉6.0 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，CaCO32 g，蒸馏水1 000 mL；产抗生素的适宜发酵条件为：接种量10%，种子液菌龄36 h，装液量50 m L／300 m L三角摇瓶，初始p H值7.2.在上述条件下，28℃、180 r／min振荡培养7 d，菌株 AL－04的抑菌率比原始发酵培养基提高了13.6%，差异达到极显著水平（P＜0.01）.

杀真菌素链霉菌；均匀设计；抗生素；发酵工艺

链霉菌（Streptomycesspp.）属于放线菌纲，是产生抗生素的重要微生物资源.菌株AL－04源于青藏高原土壤，经形态特征、生理生化特征和16S r DNA序列分析鉴定该菌株为杀真菌素链霉菌（Streptomyces fungicidicus）.其发酵滤液具有广谱抗菌活性，且对多种园艺植物土传真菌病害都有较好的防治效果（另文报道）.目前关于杀真菌素链霉菌产生活性物质的报道鲜见，国内只有文才艺等［1－2］从辽宁省丹东地区的土壤样品中分离到一株杀真菌素链霉菌YH9407，能够产生四烯类抗生素；Li等［3］从太平洋5 000 m海底沉积土壤中分离到一株杀真菌素链霉菌，能够产生低毒、防污染代谢物；Ramesh等［4］从印度洋孟加拉湾海底沉积土壤中筛选到一株杀真菌素链霉菌MML1614，能够产生高活性蛋白水解酶.筛选杀真菌素链霉菌产生的抗真菌活性组分的优化发酵培养基是高效、大量生产该新型农用抗生素的基础.均匀试验设计具有关键信息突出、试验处理少和简单易行等优点，因而被广泛地应用于试验和工艺研究［5］.本研究用单因素和均匀试验设计对菌株AL－04的发酵条件和培养基进行优化，以期为进一步的中试放大和大面积推广应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 菌种

供试链霉菌菌株AL－04，从青藏高原土壤分离纯化的4 500余株放线菌中通过平皿体外试验筛选得到［6－7］；活性检测指示菌为辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici）.

1.2 培养基原料及主要试剂

葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、黄豆粉、蛋白胨、酵母膏、酵母粉、鱼粉、动物水解氨基酸、硫酸铵、尿素.

1.3 培养基

改良PDA培养基［7］

种子培养基：牛肉膏3 g，酵母膏1 g，蛋白胨3 g，葡萄糖10 g，CaCO34 g，蒸馏水1 000 m L，p H 7.0.

原始发酵培养基：大豆粉20 g，葡萄糖10 g，可溶性淀粉10 g，蛋白胨2 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，FeSO4·7 H2O 0.01 g，CaCO32 g，蒸馏水1 000 m L，p H 7.0.

1.4 发酵滤液的制备

将菌株AL－04制成孢子悬浮液，孢子悬浮液按10%（V／V）的接种量接种于装有50 m L发酵培养基的300 m L三角瓶中，28℃、180 r／min振荡培养72 h，获得种子培养液.将种子培养液按10%的接种量放入装有50 m L发酵培养基的300 m L三角瓶中，28℃、180 r／min振荡培养7 d.将发酵培养液5 000 r／min离心10 min，上清液再经0.22μm滤膜过滤除菌，得无细胞发酵滤液.

1.5 抑菌活性的测定

以辣椒疫霉病菌作为检测菌，取2 m L无细胞滤液，按滤液∶培养基＝1∶10的比例与20 m L的改良PDA培养基（灭菌后冷却至50℃左右）混合，待凝固后，将预先培养5 d的7 mm辣椒疫霉病菌菌饼放置于混配平板上，28℃培养72 h后将培养皿取出，用游标卡尺测量菌落直径（十字交叉测量两次，取平均值），以3次平行菌落直径的平均值计算抑菌率.

1.6 发酵条件的优化

按照单因素设计，采用原始发酵培养基研究菌株AL－04不同发酵条件（发酵时间、接种量、种子液菌龄、装液量、初始p H值）下的抑菌率.

1.7 碳源和氮源的筛选

1.7.1 碳源的筛选 选用原始发酵培养基中除碳源（葡萄糖和可溶性淀粉）以外的成分，分别加入可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、玉米粉、大米粉各20 g.发酵结束后制备发酵滤液，并测定这6种发酵滤液对辣椒疫霉病菌的抑菌率.

1.7.2 氮源的筛选 选用原始发酵培养基中除氮源（大豆粉和蛋白胨）以外的成分，分别加入大豆粉、酵母粉、鱼粉、动物水解氨基酸、硫酸铵、尿素各20 g.发酵结束后制备发酵滤液，并测定这6种发酵滤液对辣椒疫霉病菌的抑菌率.

1.8 发酵培养基的优化

在上述试验的基础上，选定可溶性淀粉、蔗糖、黄豆饼粉和鱼粉4个因素的7个不同水平（表1），采用U7（74）均匀设计方案.实验数据采用DPS软件计算回归方程，得到最佳培养基配方.

2 结果与分析

2.1 最佳发酵时间的确定

摇床发酵培养2 d后每隔1 d取样一次，测抑菌活性（图1，P719）.结果表明发酵前两天未检测到抑菌活性，第3天开始具有抑菌活性，但活性很低；随着培养时间的延长抑菌率不断提高，培养至7 d时抑菌率达到最高点（抑菌率为78.6%），8 d后抑菌率开始下降，10 d后明显下降，所以最佳发酵时间为7～8 d.本研究以下的试验均为发酵培养7 d.

2.2 种子液接种量对抑菌率的影响

将培养好的种子液按体积比以2%，4%，6%，8%，10%，15%和20%不同的接种量转接到发酵培养基中，28℃振荡培养7 d后测定发酵滤液抑菌率（图2，P719）.结果表明接种量对抑菌率的影响较小，接种量为10%时，抑菌率最高，故本试验采用10%的接种量.

2.3 种子液菌龄对抑菌率的影响

将不同菌龄的种子液以10%的接种量转接到发酵培养基中，测定种子液菌龄对抑菌率的影响（图3，P719）.结果表明：种子液菌龄对抑菌率影响较大，种子液菌龄过长或过短都不利于抑菌率的提高，种子液最佳接种菌龄为36 h.

2.4 装液量对抑菌率的影响

采用300 m L的三角瓶作为摇瓶，培养基装液量分别为25 m L，50 m L，75 m L，100 m L，150 m L，灭菌后，培养36 h的种子液以10%的接种量转接到发酵培养基中，28℃振荡培养7 d后测定抑菌率（图4，P719）.结果表明：装液量为50 m L时抑菌率最高，加大装液量对抗生素的产生不利，说明菌株AL－04发酵过程中需要消耗大量氧.

图1 培养时间对抑菌率的影响Fig.1 Effect of fermentation filtrate at different fermentation time on inhibition rates

图2 接种量对抑菌率的影响Fig.2 Effect of fermentation filtrate at different inoculum sizes on inhibition rates

图3 种子液菌龄对抑菌率的影响Fig.3 Effect of different culture time of seed on Inhibition rates of fermentation filtrate

图4 装液量对抑菌率的影响Fig.4 Effect of different volume of media on Inhibition rates of fermentation filtrate

2.5 初始p H对抑菌率的影响

将配制好的发酵培养基灭菌后，用1.0 mol／L HCL或1.0 mol／L NaOH 调至p H 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，发酵培养后测定抑菌率（图5）.结果表明：发酵培养基的初始p H 值对菌株 AL－04抑菌率影响明显.初始p H值小于6.0时发酵液抑菌活性很低，p H值为7.0～8.0时的抑菌活性达到最高点，p H值为9.0时抑菌活性明显下降.这说明酸性条件下对菌株AL－04产抗生素具有抑制作用，微碱性有利于抑菌率的提高，p H值大于8.0时，抑菌率开始下降.

图5 初始p H对抑菌率的影响Fig.5 Effect of different initial p H on Inhibition rates of fermentation filtrate

图6 碳源对抑菌率的影响Fig.6 Effect of different carbon sources on Inhibition rates of fermentation filtrate

2.6 碳源的选择

本试验采用了葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、玉米粉和大米粉等6种碳源进行发酵培养.结果表明（图6，P719）：以葡萄糖为单一碳源，抑菌率很低，说明速效碳源对抑菌率影响很大；而采用迟效碳源如玉米淀粉、可溶性淀粉、玉米粉和大米粉时，抑菌率明显提高，其中2.0%可溶性淀粉为单一碳源时抑菌率最高，故将可溶性淀粉作为最适碳源.

2.7 氮源的选择

黄豆粉、玉米浆、蛋白胨、酵母膏、酵母粉、硫酸铵、尿素等均是常用的工业微生物发酵氮源，而鱼粉和动物水解氨基酸（简称为氨基酸）均含有丰富的氨基酸和维生素类物质，很适合工业发酵，但目前关于这两种氮源的报道并不多，本试验采用了这两种氮源作为备选氮源.结果表明（图7），有机氮源明显优于无机氮源，抑菌率从高到低依次为鱼粉＞黄豆粉＞氨基酸＞酵母粉＞硫酸铵＞尿素.其中以鱼粉作为氮源的发酵培养基合成的抗生素最多（抑菌率为80.4%），以黄豆粉为氮源，合成的抗生素次之（抑菌率为78.0%），考虑到生产成本及其他元素的含量变化对菌株AL－04抑菌率的影响，应采用黄豆粉和鱼粉的复合氮源做进一步的均匀试验，以确定更好的发酵培养基配方.

2.8 培养基均匀设计优化结果

在上述研究的基础上，采用4个因素7个水平的U7（74）（表1）均匀设计方法［8］对发酵培养基进行优化.

图7 氮源对抑菌率的影响Fig.7 Effect of different nitrogen sources on Inhibition rates of fermentation filtrate

表1 发酵培养基组分均匀设计及其试验结果Table 1 Uniform design and its experiment results

在试验中，以配方用量为自变量，抑菌率为因变量采用DPS软件［1－3］对均匀设计试验结果进行二次多项式逐步回归，得回归方程：

Y＝49.963 049 7－0.011 211 631 76X1×X2＋0.118 132 641 6X1×X4－0.163 128 197 36X2×X3－0.141 719 719 73X3×X4（R＝0.992 21F＝31.879 76S＝6.301 07P＜0.01）

查表F0.01＝19.21，F＞F0.01，F检验通过，该拟合方程显著性强，可信度高.

由方程直接可知菌株AL－04发酵培养基最佳配方为：黄豆粉34.0 g，鱼粉12.0 g，蔗糖2.0 g，可溶性淀粉6.0 g，蔗糖2.0 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，FeSO4·7 H2O 0.01 g，CaCO32 g，蒸馏水1 000 m L，p H 7.2.

为了进一步确定所筛选的培养基配方的优越性，将优化发酵培养基（OM）和原始发酵培养基（CM）进行抑菌率测定比较，分析表明，用优化发酵培养基培养菌株AL－04所得的发酵滤液，在稀释10倍后对辣椒疫霉病菌抑菌率达93.5%，比用原始发酵培养基的发酵滤液的抑菌率（82.3%）高13.6%（P＜0.01）（表2，P721）.

表2 优化与原始发酵培养基发酵滤液抑菌率的比较Table 2 Comparison of inhibition rate of strain AL－04 in culture filtrate from optimized and initial medium

3 结论

通过对杀真菌素链霉菌菌株AL－04产抗生素的发酵工艺研究，确定杀真菌素链霉菌菌株AL－04产抗生素的适宜发酵培养基为：黄豆粉34.0 g，鱼粉12.0 g，蔗糖2.0 g，可溶性淀粉6.0 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，FeSO4·7 H2O 0.01 g，CaCO32 g，蒸馏水1 000 m L；适宜发酵条件为：接种量10%，种子液菌龄36 h，装液量50 m L／300 m L三角摇瓶，初始p H值7.2.在上述优化条件下，28℃、180 r／min振荡培养7 d，菌株AL－04的抑菌率比原始发酵培养基提高13.6%.

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Studies on Fermentation Technology forStreptomyces fungicidicus.Strain AL－04 Producing Antibiotics

LI Zeng－bo1，YANG Bin2，LI Wen－bin1，SHI Guo－liang1
（1.CollegeofChemicalandBiologicalEngineering，TaiyuanSci－TechUniversity，Taiyuan030021，China；2.InstituteofMillet，ShanxiAcademyofAgriculturalScience，Changzhi046011，China）

In order to obtain the high antagonistic effects ofStreptomycesfungicidicusAL－04 culture filtrate on plant pathogenic fungi，the medium and conditions were studied by using single factor experiment and uniform design.The results showed that the optimum medium for antibiotics production from strain AL－04 consisted of：soybean powder 34.0 g，fishmeal 12.0 g，sucrose 2.0g，starch 6.0 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，CaCO32 g and water 1 000 m L.The inhibition ratio increased by 13.6%after strain AL－04 was cultured at 28℃for 7 d at 180 rpm under the optimized culture conditions of inoculum size 10%，the seed liquid cultivated 36 h，culture medium amount 50 m L／300 m L flask and initial p H 7.2，which was significantly higher compared to the initial medium.

Streptomycesfungicidicus.；uniform design；antibiotics；fermentation technology

S476.1；Q939.9

A

0253－2395（2012）04－0717－05＊

2011－09－06；

2011－11－07

太原科技大学青年基金（20113008）；农业部（天津市）产地环境与农产品安全重点实验室开放课题资助项目（批准日期2010－06）

李增波（1981－），男，陕西安康人，讲师，主要从事微生物资源及发酵工艺方面的研究.E－mail：lizengbo＠sina.com