NR4A1基因多态性与糖尿病肾病的相关性

(泰山医学院附属聊城二院内分泌科，山东 临清 252601)

2型糖尿病是严重危害人们健康的疾病，特别是对肾功能的影响不容忽视，由糖尿病引起的终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)在逐渐增加。糖尿病肾病从早期的高灌注、高滤过发展到ESRD，除血糖控制不良、高血压、蛋白尿、高蛋白饮食及高血脂等因素外，遗传因素在病情的逐渐进展中起着重要的作用。NR4A1做为核受体超家族中的一员，定位于12q13染色体上，在多种细胞中表达，同时功能十分广泛，参与了细胞增殖、分化、凋亡、代谢和进化过程。并能够参与调节人体一系列生理及病理反应，如能量代谢、应激、炎症反应、动脉粥样硬化、肿瘤等。由于NR4A1上述功能可以影响或加重糖尿病肾病发生、发展，因此我们对两者之间的相关性进行了研究。

1 资料与方法

1.1研究对象

1.1.1糖尿病组 按照2007年中国2型糖尿病防治指南诊断及分型标准，随机选取我科2010.10～2011.5住院及门诊的2型糖尿病患者120例，男性63例，女性57例，平均年龄(55.3±8.4)岁，平均病程(8.2±6.6)年。按照24小时尿微量白蛋白分为2组：(1)单纯2型糖尿病组(单纯DM组)：6个月内连续3次尿白蛋白排泄率≤30 mg/24 h。入选病例60例，男性29例，女性31例。平均年龄(57.6±9.3)岁，平均病程(7.8±5.3)年。(2)糖尿病肾病组(DN组)： 6个月内连续三次尿白蛋白排泄率>30 mg/24h，且肾功能正常者，并排除尿蛋白生成的药物及原发肾脏疾病等其他疾病的影响。入选病例60例，男性32例，女性28例，平均年龄(58.6±10.9)岁，平均病程(10.8±4.6)年。

1.1.2正常对照组 随机选择在我院体检的空腹及餐后2小时血糖正常的健康个体60例。男31例，女29例。平均年龄(56.5±7.2)岁。

各组间年龄及性别比例相互匹配。所有对象间均无亲缘关系。所有就诊病人签署知情同意书，并经医院伦理委员会审核通过。

1.2方法

受试者无热量摄入8小时后，于第二日清晨6点空腹抽取肘静脉血3 ml，用ACD 0.5 ml抗凝，保存在-70℃以下，用于抽提基因组DNA。

1.2.1提取全血基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的质量，紫外分光光度法检测DNA浓度及纯度(图1)。

图1 血液基因组DNA凝胶电泳检测

1.2.2基因多态性检测 依据NR4A1基因多态性位点rs744690基因序列分别设计引物:上游引物：5’-GTTATTACCTGTTCCCTCCTA-3’,下游引物：5’-CTCCTCACAACTTGGCAT-3’。94℃预变性 3 min，94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，重复完成 36个循环，最后在 72℃延伸 10 min。取扩增产物4 μl在 1%琼脂糖凝胶电泳,并在紫外灯下观察片段大小为669 bp(图2)。对同一样品进行重复三次PCR后检测，将重复出现的单一条带进行测序(图3)。

1.2.3收集样本的性别、年龄、病程、吸烟史、饮酒史、总胆固醇、甘油三酯、尿微量白蛋白、糖化血红蛋白等资料，并计算体重指数，做眼底血管检查。

1.2.4统计分析 用SPSS13.0统计软件进行数据分析。Hardy-Weinberg 平衡法检验各组基因频率的群体代表性。计量资料以均数±标准差表示。计数资料间比较用χ2检验，计量资料比较用方差分析。Logistic 回归分析检测2型糖尿病及2型糖尿病并肾病的危险因素。

图2 rs744690PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

图3 PCR产物测序分析图

2 结 果

2.1组间临床资料比较(表1) 单纯DM组和DN组HbA1c、BMI、甘油三酯、总胆固醇明显高于正常对照组(P<0.01)。

表1 各组间临床资料比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

2.2各组间基因型比较(表2) 各组中基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)。rs744690：DN组、单纯DM组、正常对照组的TT基因型频率分别为83.3%、65%、61.7%，DN组TT基因型频率明显高于单纯DM组(χ2=5.26，P<0.05)和对照组(χ2=7.06，P<0.01) 。单纯DM组与正常对照组相比rs744690TT基因型无明显差异(P>0.05)。rs2603751：各组间基因型无明显差异。

表2 rs744690基因型比较

注：与DN组比较,*P<0.05；**与DN组比较,P<0.01。

2.3DN危险因素分析(表3) Logistic 回归分析，全部DM组以有无DN为因变量，性别、年龄、病程、吸烟史、饮酒史、体重指数、总胆固醇、甘油三酯、糖化血红蛋白、rs744690基因多态性为自变量。结果显示rs744690基因多态性、糖化血红蛋白、体重指数为2型DN发生的独立危险因素(P<0.01)。

表3 DN危险因素分析

3 讨 论

人体内能量代谢是通过激素调节主要的靶组织如肝脏、肌肉、脂肪组织，进而维持的稳定。近来有报道指出，NR4A1与另外两个家族成员NR4A2和NR4A3一起，在能量代谢中发挥着重要的作用[1]。NR4A1不仅参与细胞周期调控(增殖或凋亡)，还与神经性疾病[2]、炎症[3]、肿瘤[4]、糖尿病[5]和心血管疾病[6]发生关系密切。多数疾病发生的病理生理过程中涉及能量平衡失调、巨噬细胞蓄积、血脂异常堆积和血管内膜损伤等过程，NR4A1可能参与对其的调节。而这些病理生理过程在糖尿病肾病发生过程中起到相当大的作用。孤核受体NR4A1属于核激素受体超家族中的一员，其可被多种生理学信号及物理刺激诱导表达。能快速感觉细胞外环境的变化，同时迅速产生反应为NR4A1孤核受体亚家族的显著特性。

本研究探讨了NR4A1基因多态性在糖尿病肾病、单纯糖尿病及正常人中的区别，试图发现其在遗传易感性方面的作用。基因多态性与疾病相关性方面有时会因为人种不同而出现不同结论，例如VEGF基因多态性与糖尿病肾病相关性研究在英格兰高加索人和汉族黄种人中得出不同结论。Karsten Müssig等[7]以德国南部白人为对象的研究发现NR4A1基因多态性在T2DM和正常对照组之间无明显差异，通过实验我们也得出相同的结论。在此基础上进一步分析发现rs744690基因多态性为2型DN发生的独立危险因素，这可能与NR4A1基因除与炎症、细胞凋亡、神经营养有关外，还参与应激反应及交感神经激活有关，氧化应激可通过NADPH氧化酶和血管内皮生长因子(VEGF)通路在DN的发展中起决定性作用。总体分析，DN的发病是一个多因素共同作用的结果。单就遗传方面，DN是一个多基因遗传易感性疾病。醛糖还原酶(AR)基因、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1) 基因、血管紧张素 转换酶(ACE)基因、一氧化氮合酶(NOS) 基因、血管内皮细胞生长因子等均被报道为DN的易感基因。目前暂无有关NR4A1与糖尿病及糖尿病肾病关系的报道。

综上所述，本研究虽然发现NR4A1与糖尿病肾病存在联系，但限于样本量的局限性，不能完全确定两者联系密切程度，并且两者通过何种机制建立联系有待进一步研究。

[1] Zhan Y，Du X，Chen H，et al. Cytosporone B is an agonist for nuclear orphan receptor Nur77 [J]. Nat Chem Biol，2008，4(9)：548-556.

[2] Nomiyama T，Zhao Y，Gizard F，et al. Deficiency of the NR4A neuron-derived orphan receptor-1 attenuates neointima formation after vascular injury[J]. Circulation，2009，119(4):577-586.

[3] Bonta PI，Matlung HL，Vos M，et al. Nuclear receptor Nur77 inhibits vascular outward remodelling and reduces macrophage accumulation and matrix metalloproteinase levels [J]. Cardiovasc Res，2010，87(3)：561-568.

[4] Liu JJ,Zeng HN,Zhang LR,et al.A unique pharmacophore for activation of the nuclear orphan receptor Nur77 in vivo and in vitro[J]. Cancer Res，2010，70(9)：3628-3637.

[5] Pearen MA，Muscat GE. Minireview: Nuclear hormone receptor 4A signaling: implications for metabolic disease[J]. Mol Endocrinol，2010，24(10)：1891-1903.

[6] Akram T，Hasan S，Imran M，et al. Association of polycystic ovary syndrome with cardiovascular risk factors [J]. Gynecol Endocrinol，2010，26(1)：47-53.

[7] Karsten Müssig,Fausto Machicao,Jürgen Machann,et al.No association between variation in the NR4A1 gene locus and metabolic traits in white subjects at increased risk for type 2 diabetes[J].BMC Medical Genetics, 2010, 11:84.