Stathmin在胃癌组织中的表达及临床意义

王庆才 李君山 井夫春 李 磊 魏 玮 王 越

(泰山医学院附属泰山医院消化内一科，山东 泰安 271000)

胃癌是原发于胃部的一种常见的恶性肿瘤，由于病情发展快，早期诊断率低，中晚期患者治疗效果有限，同时单纯手术的疗效差[1]。本实验从临床工作实际出发，选择与胃癌密切相关的Stathmin，联合应用免疫组化方法和RT-PCR技术，研究其在胃癌中的表达及其与临床病理特征之间的关系，探讨其在胃癌中所起的作用，有助于临床了解胃癌病人判断预后及指导术后化疗药物的选择。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集泰安市中心医院2008年1月～2008年6月间手术切除并经病理证实、资料完整的胃癌组织标本及其癌旁组织标本各34例，术前均未接受放、化疗，其中男22例，女12例，年龄32～75岁，平均(54.6±7.2)岁，所制切片按全国胃癌协作组标准由专职病理科医师复检，病理类型：高分化腺癌7例，中分化腺癌9例，低分化腺癌18例。淋巴结转移者25例，无淋巴转移者9例。TNM分期：I～II期12例、III～IV期22例，其中未浸透浆膜者6例，穿透浆膜者28例。

1.2 方法

1.2.1免疫组化方法

采用免疫组化SP法，切片常规脱蜡，微波修复抗原，滴加一抗(为兔IgG)，置于4°C冰箱中过夜。滴加生物素化二抗，DAB显色，苏木素复染，阴性对照片用PBS液替代一抗，双盲法判定结果，细胞阳性染色为棕黄色颗粒沉淀。由两名未参与实验的病理科医生协助免疫组化结果的判断，显微镜下观察染色结果。每例标本选择5个有代表性的高倍视野，每个视野数200个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分比，取平均值，参照Wachters等[2]的方法来分析免疫组化蛋白的表达水平，即阴性表达：不表达或阳性细胞数<10%；阳性表达：阳性细胞数>10%。

1.2.2RT-PCR方法

1.2.2.1总RNA提取

采用总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)，从冰冻胃癌组织中提取总RNA。电泳和紫外分光光度法检测提取核酸的浓度及质量。

1.2.2.2RT-PCR检测Stathmin mRNA水平

使用MMLV逆转录酶将总RNA后逆转录成cDNA，再用PCR扩增stathmin和内参基因β-actin。β-actin上游引物：5-CTTAATGTCACGCACTTC-3，下游引物：5’-GGGCGCCCCAGGCACCA-3，产物长540 bp。

Stathmin上游引物：5-CCCCTTTCCCCTCCAAAGAA-3，下游引物：5-TCGCAAACGTTCCAGTTTGG-3，产物长267 bp。取7μl扩增产物用2%琼脂糖电泳分离，经溴化乙啶染色后，用凝胶成像系统测定Stathmin和β-actin基因的灰度比，作为Stathmin mRNA的相对表达水平。

1.3 统计学方法

全部数据用SPSS13.0统计软件进行统计分析，采用χ2检验，Fisher精确概率法，比较各组是否有差异。检验水准以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化结果

Stathmin蛋白在不同分化程度的胃癌组织中均有不同程度的表达，主要在细胞核及细胞质，部分间质细胞也有表达，呈棕黄色或棕褐色颗粒(图1)，但在癌旁组织中的表达则明显减弱(图2)。发现Stathmin蛋白表达与临床分期、浸润深度及淋巴转移分化程度均正相关，而与年龄、性别无关(表1)。

图1 Stathmin在低分化腺癌中的表达(×400)

图2 Stathmin在癌旁组织中阴性表达(×400)

临床病理资料nStathmin蛋白表达阳性(%)阴性(%)P年龄≥601811(61.1)7(38.9)>0.05<601612(75)4(25)性别男2215(68.2)7(31.8)>0.05女128(66.7)4(33.3)TNM分期I～II125(41.7)7(58.3)<0.05III～IV2218(81.8)4(18.2)分化程度高中分化167(43.75)9(56.25)<0.05低分化1916(88.9)2(11.1)浸润程度未浸透浆膜61(16.7)5(83.3)<0.05穿出浆膜2822(78.6)6(21.4)淋巴转移 有2520(80)5(20)<0.05 无93(33.33)6(66.67)

2.2 RT-PCR结果

Stathmin基因在胃癌组织中可测及mRNA表达，高于癌旁组织中的(P<0.05)，将组织每一所测ERCC1和TS基因扩增片段灰度值与相应的内参照β-actin基因扩增片段灰度值的比值作为其mRNA表达水平的半定量指标(图3)

图3 StathminmRNA电泳结果

注：1、2为胃癌组织；3为癌旁组织；M为Marker。

2.2.1胃癌组织中Stathmin mRNA表达

34例胃癌组织标本中，27例表达Stathmin mRNA，其表达在患者年龄、性别方面均无统计学差异，而在TNM分期、浸润程度及有无淋巴转移分化程度方面存在统计学差异(表2)。

表2 StathminmRNA阳性表达的临床病理资料分析

3 讨 论

Stathmin蛋白与细胞的增殖和分化过程密切相关，通过与微管系统的相互作用，参与细胞的有丝分裂及增殖、分化，影响组织的再生，Stathmin可以在细胞间期及随后的有丝分裂过程中促使微管解聚，是细胞内微管动力学的调控者。主要通过Stathmin磷酸化水平的改变，来调节Stathmin的促使微管解聚的活性。研究表明细胞内、外有多种细胞因子、抑癌基因及癌基因的表达产物，经过直接或者间接与Stathmin作用引起细胞生物学行为改变[3]。

本研究应用免疫组化SP法和RT-PCR技术进行Stathmin的检测，发现Stathmin在胃癌组织中的mRNA和蛋白的表达水平均高于癌旁组织，提示Stathmin基因与胃癌的发生和发展密切相关。这与国内外学者的研究结果相一致，Stathmin的高水平表达可以在多个系统多种肿瘤中检测到，在乳腺癌，子宫内膜癌和卵巢癌、前列腺癌等生殖系统肿瘤中以及在口腔鳞状细胞癌和腺样囊性癌、食管癌，大肠肿瘤，肝癌，胰腺癌消化系统发现Stathmin的高表达[4]。Sadowl等[5]研究结果表明于各种各样的内分泌肿瘤都有Stathmin的存在，尤其在低分化、高增殖肿瘤，包括未分化甲状腺癌、Merkel细胞癌、皮肤癌和小细胞肺癌。Stathmin在恶性嗜铬细胞瘤可作为诊断标记。Saldanha等[6]发现许多恶性上皮癌中失调的纤维蛋白溶酶原激活起重要作用。

通过分析Stathmin与胃癌临床病理特征的关系发现，Stathmin蛋白的表达与胃癌临床分期、浸润深度及淋巴转移均正相关，而与年龄、性别无关，提示Stathmin蛋白与胃癌浸润、转移等恶性行为有关，Stathmin与胃癌的预后存在相关性。Stathmin在多种恶性肿瘤其表达水平与肿瘤恶性度和预后密切相关，已有研究表明Stathmin表达与食管癌，大肠肿瘤，肝癌的分化程度、淋巴结转移、肿瘤浸润深度及TNM分期显著相关[7-8]。Stathmin水平的显著升高与肿瘤的TNM (肿瘤淋巴结转移)分级分期密切相关，III期和IV期中的Stathmin蛋白的表达水平显著高于I期和II期，可作为预后指标。

Stathmin表达与细胞增殖密切相关[9]，而Stathmin的高水平表达对于维持肿瘤细胞的高增殖率是必需的，通过利用反义核酸、核酶、单克隆抗体、Stathmin蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法，封闭该基因表达均证实抑制其表达可使细胞受阻于G2/M期，同时可以逆转恶性肿瘤的表型，Stathmin基因及其表达产物是一个极具吸引力的恶性肿瘤生物治疗新靶点[10]。已有研究通过抑制Stathmin的表达和功能可抑制恶性肿瘤细胞的生长、扩散，在红白血病、恶性脑胶质瘤、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、成骨肉瘤细胞等恶性肿瘤肿瘤中已得到证实[11-13]，Alli等[14]发现微管的聚合状态能够影响其与化疗药物的结合，Stathmin的高表达能干扰紫杉醇与微管的结合，降低对紫杉类药物的敏感性；增加长春碱类药物与微管的结合，增加肿瘤细胞对长春碱类药物的敏感性。可以利用相关基因工程技术更加高效地抑制Stathmin蛋白在胃癌细胞中的表达从而高效干扰肿瘤细胞的增殖与分化，同时也可协同增效一些肿瘤化疗药物的抗肿瘤疗效，抑制肿瘤细胞Stathmin基因的表达与紫杉醇类药物有明显的协同抗癌效应，将为肿瘤的治疗开辟一个新思路。

本研究结果显示，Stathmin的表达水平与胃癌的发生、发展密切相关，研究还显示Stathmin与胃癌的浸润、转移等恶性行为有关，提示Stathmin高表达者预后差。Stathmin不但可能作为胃癌发生和发展的分子标志之一，也同样可能成为生物治疗的一个新靶点。

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