仔猪胃肠道优良性状乳酸杆菌的分离和鉴定

蒋建军，肖红冉，张杰，陈少秀，孙磊，孟小江，王鹏雁

（石河子大学动物科技学院，石河子，832003）

健康仔猪主要通过产道时获得了母体的微生物，并在生长环境中进一步接触了各种微生物，经过相互适应和选择，一些特定的微生物在仔猪胃肠道内定植。新生仔猪出生24h胃肠内已定植了乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌、大肠杆菌、消化球菌、拟杆菌和酵母菌等，8－22日形成以乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、大肠杆菌和消化球菌为优势菌的定型菌群［1－3］。这些菌群在动物体内的存活能力的高低将直接影响其健康促进作用的发挥，其中乳酸杆菌为体内优势菌群，对动物体具有广泛的有益生理功能［4－6］。因此，其可部分替代抗生素的功效，有效降低药物残留和减少药物的耐药性。目前益生菌的安全状况越来越受到公众的关注，因此对益生菌的正确鉴定是保证其产品食用安全性的重要基础。

本实验利用乳酸菌选择培养基从健康仔猪胃肠道分离鉴定并筛选出优良性状的有益乳酸菌，以期为乳酸菌的进一步正确利用奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

Rogosa SL完全选择性培养基和MRS培养基（购自Sigma公司，根据说明书制备液体和固体的培养基，用于乳酸杆菌的选择培养和分离后细菌的培养）。API 50CHL V5．0试剂盒购自梅里埃（中国）有限责任公司。猪源大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为本实验室保存。

1．2 方法

1．2．1 实验动物和样品采集

从石河子某猪场选取30日龄健康长白猪2头。处死后立即无菌采集十二指肠、空肠、回肠、结肠部位，剪取5cm2胃肠粘膜，用无菌生理盐水冲洗至无肉眼可见的食糜后，将胃肠粘膜浸入10mL PBS（pH 7．4）液中，用镊子夹住剧烈摇动5min。静置2～3min，上清液用于乳酸杆菌的分离。

1．2．2 菌种的分离

用移液枪分别吸取50μL胃肠粘膜处理后的上清液接在Rogosa SL完全选择性培养基上，用L棒将上清抺匀。将培养基置于37℃的CO2培养箱中培养48h。挑取培养基上的单个针尖大小的菌落，接于MRS培养基上置于37℃的10%CO2培养箱进行厌氧培养24h观察生长情况。挑取培养基上的单个菌落在接于MRS液体培养基中培养24h，观察液体培养基是否变浑浊，有浑浊的放置4℃ 冰箱贮藏备用。

1．2．3 乳酸杆菌的初步鉴定

1．2．3．1 革兰氏染色 挑选出 MRS划线平板上以及Rogosa SL平板上的单个菌落进行革兰氏染色。镜下观察分离菌形态。菌体呈红色的为阴性，紫色的为阳性，选择革兰氏阳性菌、染色浓度深浅不均匀、形态不一的杆菌，进一步做接触酶试验。

1．2．3．2 接触酶实验 挑取Rogosa SL培养基在厌氧条件下培养的单个菌落，滴加3%H2O2混匀，如果没有气泡冒出说明是阴性，如有气泡说明是阳性。

1．2．4 菌种的种属鉴定

运用API鉴定系统以API 50CHL V5．0试剂盒对分离的乳酸杆菌进行鉴定。所有操作按照说明书中的操作方法进行。

1．3 优良性状乳酸菌的筛选

1．3．1 小鼠安全性实验

取体重15～20g的小白鼠12只，随机分成4组，每组3只，其中1、2、3组为试验组，口服乳酸菌菌液0．5mL，其浓度为6．0×109CFU／mL；第4组为对照组，口服生理盐水0．5mL。连续观察7d小白鼠的健康状况，并于7d后剖检小鼠，观察其内脏器官与对照组有无差异。

1．3．2 生长曲线的绘制

将分离鉴定的菌种加入全波段酶标仪中，每种菌做3个平行，于37℃、8%CO2温箱中培养，每隔0．5h测出OD600值，记录数据，描绘出乳酸杆菌的生长曲线。

1．3．3 耐酸实验

设4个不同pH处理组（pH值分别为1．5、2．5、3．5、4．5），分别用1mol／L HCl调节 MRS液体培养基至上述pH值。将生长速度较快的菌活化，以5%（V／V）的接种量分别接种上述各处理的 MRS液体培养基，37℃静置培养。

在接种初始及接种后30、60、90、120、150min取上述各处理组菌液，接种到MRS平板上37℃培养24h后观察菌落生长个数。

1．3．4 胆盐耐受实验

实验设4个胆盐处理组，MRS培养基中分别加0．1%、0．2%、0．3%、0．4%的猪胆盐。取1mL 培养液1．0×109CFU／mL接种于9mL高胆盐浓度MRS液37℃培养稀释相应的倍数，在培养接种后1、2、3、4h取上述对照及各处理中培养菌液，取0．1 mL涂MRS板接种到MRS平板上37℃下培养24 h后观察菌落个数。

若生长数目超过30个（3．0×106CFU／mL）则表明其生长良好能够耐该浓度的胆盐；若生长数目在5～30个则表明其生长较差，耐受该浓度胆盐较差；若生长数目小于5个则表明其不生长，不能耐受该胆盐浓度。

1．3．5 体外抑菌实验

取90mm的平皿，注入灭菌的营养琼脂，凝固后取37℃，24h培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌液适量涂布于平板之上，静置30min，使菌液充分吸收。取灭菌的玻璃管在平板上打孔，以少量灭菌营养琼脂封底，分别在孔中加入制备好的乳酸菌代谢产物及活菌体。同时设MRS培养液做对照。将加完样的平皿小心放入37℃恒温箱内，培养24h后取出测量抑菌圈大小，计算其平均值。

2 结果与分析

2．1 乳酸杆菌的分离和初步鉴定

应用Rogosa SL完全选择性培养基分离的菌落呈圆形、表面隆起、边缘整齐的灰白色或乳白色，表面湿润光滑。显微镜下为革兰氏阳性中等大小杆菌或短杆菌，散在或栅栏状成堆排列（图1）。

经初步筛选从仔猪胃肠道分离鉴定出60株乳酸杆菌。其中，来源于胃部16株，空肠8株，十二指肠4株，结肠22株。

图1 分离菌形态学观察Fig．1Morphology observation of isolated bacteria

2．2 API生化鉴定

经API鉴定了16株乳酸菌，其中9株是嗜酸乳杆菌，5株是发酵乳杆菌，2株是唾液乳杆菌，鉴定结果见表1。

2．3 小鼠安全性实验

经过1周的饲喂，对照组和试验组的小白鼠生长状况健康良好，食欲正常，未出现发病和死亡，剖检脏器未见异常，表明各分离菌株经口服对小白鼠无毒副作用，菌株安全性能良好。

表1 API系统鉴定结果Tab．1Results of API identification

2．4 乳酸菌生长曲线的绘制

用全波段酶标仪对分离鉴定的13株乳酸杆菌进行OD600值的测定，分别画出8株嗜酸乳杆菌和5株发酵乳酸杆菌的生长曲线（图2、3）。

13株菌的生长曲线（图2）表明，8株嗜酸乳杆菌和4株发酵乳杆菌生长状况均良好。从中选择变化大、生长时间较长的L4号菌、L8号菌和L10号菌种，作为微生物添加剂的候选菌株做进一步研究。其中L14号菌生长缓慢不适宜作为微生物添加剂。

图2 8株嗜酸乳杆菌的生长曲线Fig．2Growth curve of 8strains Lactobacillus acidophilus

图3 5株发酵乳杆菌的生长曲线Fig．3Growth curve of 5strains Lactobacillus fermenti

2．5 耐酸实验

本实验设置了4个处理组，观察并比较各个处理组的活菌个数，结果显示，pH在1．5时，L7（嗜酸乳杆菌）和L14（发酵乳杆菌）对酸的耐受能力最强。pH 2．5时，各个平板不同时间段菌落个数均大于50个，并且随着时间的增加，活菌个数也相应的增加。

2．6 胆盐耐受实验

本实验设0．1%、0．2%、0．3%、0．4%四个不同的胆盐浓度，观察各时间点（1h、2h、3h、4h）的生长情况及活菌数，结果显示，L7（嗜酸乳杆菌）、L3（嗜酸乳杆菌）、L14（发酵乳杆菌）对0．2%的胆盐浓度耐受性比较强，而只有L14（发酵乳杆菌）对0．3%浓度的盐仍有较好的耐受能力。

2．7 体外抑菌试验

经测量，L7（嗜酸乳杆菌）和L14（发酵乳杆菌）的代谢产物对葡萄球菌、大肠杆菌有明显的抑菌作用，其中对葡萄球菌的作用出现的晚而弱，而未接种的MRS液对致病菌无抑菌现象。

3 讨论

1）本试验选择断奶后健康的仔猪胃肠道不同部位的粘膜，是由于乳酸杆菌对动物种属、年龄、消化道部位的粘附力及生长繁殖等均具有很强的特异性［7］。选择从粘膜分离而不是从食糜分离，是由于自食糜分离的乳酸杆菌很可能是从饲料中带入，也可能是粘膜上脱落下来的不适应生存的细菌。而从粘膜分离到的乳酸杆菌本质上可以在胃肠道定殖。这些菌是与宿主长期自然选择相互适应的结果，所具有的生物特性是其本质属性，不易发生改变。

2）本实验中从不同部位提取的8株嗜酸乳杆菌、5株发酵乳杆菌及唾液乳杆菌的生长情况均不同。这是由于胃肠环境的不同导致菌种的个体差异还是存在亚种或是变异株，还需要进一步研究。耐酸实验与胆盐耐受实验中发现这些菌都既耐酸又耐胆盐。

3）乳酸杆菌的保存与复活是制约本实验进程的一个关键因素，所以本研究参照了文献［8］中的保存方法。实验中发现多株乳酸杆菌在MRS斜面的保存在1周内死亡，而当使用MRS甘油冷冻保存后，则至少保存8个月以上。

4）本实验应用API系统对乳酸杆菌进行了快速鉴定，为健康仔猪菌群分布提供了有益的数据。所分离的乳酸杆菌菌株主要为嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌，在鉴定的菌株中，其中50%菌株来源于胃，其他菌株来源于各个肠道。在分离鉴定过程中，由于在结肠和胃上分离到大量的菌株，而在空肠、十二指肠上分离到的较少，所以在鉴定时选取的菌株在胃和结肠上较多。同时，由于胃黏膜上分离出的菌株形态较多，而结肠黏膜上分离出的菌形态单一，所以在鉴定菌株时胃粘膜上鉴定的细菌较多，而结肠其次。另外，据实验结果可以看出猪胃中分离到的乳酸杆菌可能对胃的粘附力较好，而对肠道粘膜的粘附力较差［9］。

乳酸杆菌制剂治疗由于菌群失调引起的各种下痢，均有明显的防治效果［10］，在研制乳酸菌制剂时菌株的选择必须根据在猪体内酸杆菌的适应性来筛选乳酸杆菌的制剂添加，如何使用也要根据猪体内乳酸杆菌的变化情况而定。因此，本研究为此提供了一定的科学依据。

［1］何明清．动物微生态学［M］．北京：农业出版社，1994：2－8．

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［9］凌代文．乳酸菌分类鉴定及实验方法［M］．北京：中国轻工业出版社，1999：1－25．

［10］马青山，余占桥，张日俊．乳酸杆菌制剂及其在维护断奶仔猪肠道健康中的应用［J］．饲料工业，2010，31（15）：10－12．