降胆固醇嗜酸乳杆菌的诱变选育

沈雁飞，单颖，柳明杰

(辽宁医学院免疫病原生物学教研室，辽宁锦州121001)

胆固醇在体内有着重要的生理作用，但当其过量时会导致高胆固醇血症，并诱发动脉粥样硬化、冠心病、脑中风等心脑血管疾病［1］。随着国人生活水平的提高、肉类饮食的增加，现代城市人群胆固醇的摄入量普遍超标［2］。在不改变饮食习惯的情况下，降低人体内胆固醇含量已经成为医学界和食品界关注的重要课题。临床实验证明多种乳酸菌制品具有降低血清胆固醇含量的功效，从而降低心脑血管发病率［3-6］。利用乳酸菌及其发酵食品清除体内多余的胆固醇，具有安全、价廉、多重保健等优势。利用诱变育种技术可以获得更加高效、特效乳酸菌［2，5］。本研究利用亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)诱变嗜酸乳杆菌，而后筛选出胆固醇清除性能良好的菌株，并利用大白鼠进行试验，为今后生产高效安全的降血清胆固醇乳酸制剂提供优良的候选菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、试剂及实验动物嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，辽宁医学院微生物实验室保藏;亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)、胆固醇和牛胆汁酸盐，美国Sigma公司;总胆固醇(TC)及高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)测定试剂盒，上海荣盛公司;甘油三酯(TG)测定试剂盒，浙江东颐公司;分光光度计，上海第三仪器厂;SD大鼠购自于中国医科大学实验动物中心(SCXK(辽)2003-0009)。

1.1.2 主要培养基①MRS琼脂培养基:MRS培养基添加1%(质量体积比)琼脂，121℃灭菌20 min后，冷却制成MRS琼脂培养基;②胆固醇MRS培养基:MRS液体培养基中添加胆固醇至0.3 g/L，121℃灭菌20 min后，添加等体积无菌血清制成含胆固醇培养基;③脱脂乳培养基(质量体积分数，%):脱脂奶粉10，绵白糖5，混匀后95℃保温杀菌20 min，待冷却至40℃左右待用;④高脂饲料配方(质量分数，%):猪油10，胆固醇0.3，基础饲料89.7。

1.2 方法

1.2.1 嗜酸乳杆菌生长曲线测定嗜酸乳杆菌接种于50 mL MRS液体培养基中，37℃静置培养24 h后转接3次充分活化。将活化嗜酸乳杆菌按3%(体积比)接种量接种到装有0.2 L MRS培养基的三角烧瓶中，37℃静置培养，每隔2 h取均匀悬浮液20 mL，测定OD600值。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制生长曲线。

1.2.2 嗜酸乳杆菌的诱变方法按嗜酸乳杆菌生长曲线，取对数期嗜酸乳杆菌，充分悬浮后转移到50 mL试管中，加入诱变剂NTG，使其作用浓度为1 g/L，将试管在25℃放置10、20、30、40、50、60 min，离心后利用MRS冲洗3次，逐级稀释，取50 μL均匀地铺到MRS琼脂培养基上，放置到密闭无氧箱中，培养24～48 h。根据对照，菌落计数，确定诱变后10%存活率的条件。以确定的条件进行大量突变实验，挑选在琼脂培养基上生长较快，个体较大的黄色诱变菌落，分别进行接种传代，挑选60个稳定的菌株，以Y1～Y60进行命名。

1.2.3 耐渗透压能力的测定在MRS固体培养基中加人NaCl，使其浓度分别为2%、4%、6%、8%(质量体积比)。将诱变菌种划线接种于含不同浓度NaCl的MRS固体培养基中，37℃培养48 h，观察嗜酸乳杆菌的生长状况。

1.2.4 耐胆酸盐能力的测定在MRS培养基内加入牛胆酸盐，使其浓度分别为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%(质量体积比)，菌种按10%(体积比)量接种于0.1 L含牛胆汁酸盐的MRS培养基中，37℃恒温培养，定时取样，以0 h活菌数量为对照，记录嗜酸乳杆菌存活率。

1.2.5 降胆固醇嗜酸乳杆菌的体外筛选按5%(体积比)接种量接种嗜酸乳杆菌于液体MRS胆固醇培养基中，摇匀后立即取2 mL样品，12 000 r/min离心5 min，取上清测定胆固醇含量做对照。剩余接种样品继续在37℃静止培养48 h后同样测定上清胆固醇含量。胆固醇含量测定方法如下:液体培养基精确称取胆固醇溶于无水乙醇中做成1 g/L的标准液，并进一步利用无水乙醇配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L的梯度溶液用于绘制胆固醇标准曲线。待测样品0.5 mL与3 mL无水乙醇和2 mL 50%KOH(质量体积比)震荡混合，在60℃水域加热10 min，待冷却后加入0.005 L正己烷并混合均匀。此后加入3 mL蒸馏水，静置20 min分层，抽取正己烷层2 mL，加入2 mL邻苯二甲醛，25℃放置10 min后再加入1 mL浓硫酸并混合均匀。最后抽取2 mL测定OD550值计算样品胆固醇质量浓度。

1.2.6 实验动物分组并构建高脂模型雄性SD大鼠60只，体重180～220 g之间，普通饲料正常饲养1周后，随机分为4组，每组12只:A对照组，饲喂普通饲料;B高脂组，饲喂高脂饲料;C脂奶组，高脂饲料中添加与D组等量的脱脂奶粉及白糖;D酸奶组，在高脂饲料中按1 L/kg饲料添加酸奶。以上饲料均制成颗粒。大鼠自由饮水进食，每隔2 d换新鲜饲料。酸奶是利用接种5%(体积比)的嗜酸乳杆菌到脱脂乳培养基中，37℃静置培养24～48 h至形成凝乳。

1.2.7 实验大鼠血脂测定按1.2.6饲料要求喂养大鼠。在0 d和27 d收集粪便。于0 d和28 d的采血前12 h禁食，称重。血脂测量采用尾静脉取血0.001 L，4℃放置过夜，12 000 r/min低温离心10 min，分离血清测定血脂。收集的粪便冷冻干燥后于研钵中磨细混匀，干燥器中保存待测。

1.2.8 TC、TG、HDL-C的检测方法取实验动物血清适量，分别依试剂盒的操作要求采用比色法测定TC、TG和HDL-C。用分光光度计测定TC、TG、HDL-C最终含量。大鼠粪便中的TC:取大鼠粪便粉末0.19 g，用甲醇氯仿混合液45℃水浴提取1 h，邻苯二甲醛比色法测定粪便中TC含量。

1.2.9 统计分析采用SPSS11.5进行数据方差分析。

2 结果与分析

2.1 最佳诱变时间测定

研究表明致死率在80%～90%时导致的突变为正向突变［2，5］。本研究中嗜酸乳杆菌的诱变最佳条件为NTG 1 g/L、30 min，达到90.31%的致死率。

2.2 耐渗透压能力的测定

渗透压对嗜酸乳杆菌的生长具有一定的影响，嗜酸乳杆菌耐渗透压能力是鉴别菌种优劣的标准之一［7］。本研究通过耐渗透压能力的测定显示，绝大部分突变菌株保留了原菌株较好的耐渗透压特性。除Y11、Y23、Y25、Y37、Y38、Y44、Y56耐渗透力较差，在NaCl为6%的浓度下就抑制生长外，其余突变菌株均可拮抗6%浓度NaCl生长。具有良好的耐渗透压特性提示突变菌株具有良好的适应性，在发酵成乳酸制品、混合饲料及食用乳酸制品过程中可保持理想的生物学活性。

2.3 耐胆酸盐能力的测定

胆盐是胆汁的重要成分，在人体中以胆酸钠盐为主要存在方式。胆盐对嗜酸乳杆菌生长具有一定的抑制作用。嗜酸乳杆菌在进入十二指肠后暴露在胆盐中，如果不具备抗胆盐能力，就会丧失其生物学活力，从而降低其降胆固醇的功能，所以优良的嗜酸乳杆菌需要具备良好的抗胆盐能力［7］。本研究中耐胆酸盐能力的测定表明，在挑选的60株突变菌株中，除去耐渗透压能力较差的以上7株嗜酸乳杆菌株外的53株突变株中，有8株嗜酸乳杆菌突变株，包括Y13、Y17、Y26、Y27、Y33、Y39、Y48、Y50，具有较好的耐胆盐能力。由图1可知，突变菌株Y27和Y48嗜酸乳杆菌在胆盐0.5%浓度条件下1 h存活率均超过50%，Y48在0.5%浓度条件下1 h存活率达到64.87%，2 h存活率达到33.17%。Y27和Y48在1%浓度2 h存活率均分别达到15.86%和21.24%。从图示可以了解Y27和Y48突变菌株与原菌株的耐胆盐能力相似，具有良好的抗胆盐能力，为在高胆盐的消化道环境中发挥正常生理功能奠定基础。

图1 乳酸杆菌在胆盐中的存活率分析Fig.1 Survival rate of Lactobacillus acidophilus in MRS contained bile salts

2.4 诱变嗜酸乳杆菌清除胆固醇能力测定

在进行耐渗透压、抗胆盐实验以后，利用获得的8株突变菌进行体外降胆固醇实验。嗜酸乳杆菌对降胆固醇筛选培养基中胆固醇的脱除率见图2。在含有胆固醇的MRS培养基中培养48 h后，Y27和Y48体现出良好的清除胆固醇能力，胆固醇清除率分别达到了(53.43±2.3)%和(61.44±1.8)%。比较原嗜酸乳杆菌，Y27和Y48胆固醇清除率分别提高了61.32%和85.51%。

图2 乳酸杆菌胆固醇清除率分析Fig.2 Clearance rate of cholesterol by Lactobacillus acidophilus

2.5 生长曲线的测定

对原嗜酸乳杆菌的生长曲线测定可以用于确定良好的突变时机，对于已经完成突变的嗜酸乳杆菌进行生长曲线的测定可以更好地了解突变菌的生长特征。如图3所示，原嗜酸乳杆菌和Y27及Y48的生长曲线相似，突变的嗜酸乳杆菌Y27和Y48与原嗜酸乳杆菌均在培养16～18 h进入平台期。经过18 h培养，原菌株、Y27和Y48的细菌计数分别为1.79×1012、1.81×1012和1.92×1012cfu/L。以上结果均提示突变的菌株Y27和Y48除具有良好的耐渗透压、抗胆盐能力外，并没有丧失良好的生长能力。

2.6 发酵乳对大鼠TC、TG、HDL-C的影响

为进一步验证突变嗜酸乳杆菌的降胆固醇能力，本研究选取体外筛选得到的体外降胆固醇能力最高的乳酸突变菌Y48发酵酸奶，并按照1.2.6分组进行动物实验。28 d后，各实验组大鼠血脂水平见表1。高脂组血清TC含量显著高于对照组(P＜0.05)，说明高脂模型已成功建立。酸奶组的血清TC和TG含量比高脂组显著降低(P＜0.05)。而奶脂组与高脂组相比有所升高但差异不大，说明未发酵奶本身并没有降胆固醇作用。与高脂组相比，酸奶组大鼠的HDL-C并没有显著的差异(P＞0.05)，间接说明酸奶组的低密度胆固醇要低于高脂组。实验大鼠的体重变化观察表明，酸奶组的体重明显低于高脂组和奶脂组(P＜0.05)。

图3 各乳酸杆菌的生长曲线分析Fig.3 Growth curve of Lactobacillus acidophilus

如图4所示，实验大鼠奶脂组、高脂组和酸奶组粪便内胆固醇含量均高于对照组。其中酸奶组大鼠粪便中的胆固醇含量最高，比对照组高350.31%，比高脂组高116.67%，比奶脂组高110.42%，说明突变菌株Y48的发酵乳可以清除更多的肠道中的TC，从而减少TC在肠道中的吸收。

图4 乳酸杆菌发酵奶对大鼠粪便中TC含量影响的分析Fig.4 Concentration of TC in feces after feeding with yogurt

3 讨论

本研究旨在利用NTG诱变嗜酸乳杆菌获得降胆固醇的优良菌株。利用NTG作用浓度为1 g/L，作用时间为30 min的条件进行诱变后，从挑选的生长良好的60个突变菌株中筛选出Y48突变菌株。Y48突变菌株与原菌株保持相似的生长速度，在MRS培养基中培养18 h后菌浓度达到了1.92×1012cfu/L。Y48菌株具有良好的耐渗透压能力，在6%的NaCl琼脂MRS培养基上生长良好。此菌株也具有良好的抗胆盐能力，在0.5%胆酸MRS培养基中培养1 h的存活率可达到64.87%。Y48菌株在含胆固醇MRS培养基培养48 h后，降胆固醇(61.44±1.8)%。利用高脂肪饲料喂养SD大鼠，并在饲料中添加Y48发酵乳，28 d后Y48发酵乳组血清TG、TC比高脂肪模型组明显降低(P＜0.05)。粪便中的TC明显升高。以上实验成功获得了优质的降胆固醇乳酸杆菌Y48，为生产出优质降胆固醇发酵乳制品提供了优良的候选菌种。

表1 乳酸杆菌对大鼠血清中胆固醇影响分析Table 1 Influence of yogurt on serum lipids and body weigh of SD rats

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