1株抗根结线虫红树林放线菌的筛选与鉴定

魏华，刘敏，鲍时翔，朱军，黄惠琴*

(1.海南大学环境与植物保护学院，海南海口570228;2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南海口571101)

根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类分布广、危害大、难以防治的植物寄生线虫，严重危害农作物生产。在我国热带、亚热带地区及寒带温室内作物、蔬菜中都有根结线虫发生，一般农作物会减产10%左右，严重的高达75%以上［1］。此外，根结线虫能使真菌和细菌更易于侵染植物，是诱发植物病害的重要原因之一［2］。防治根结线虫病害主要采用化学农药，毒性高，且污染环境。近年来，从微生物代谢产物中寻找具有抗根结线虫活性的物质，受到国内外的高度重视。红树林生长于热带、亚热带海岸潮间带，受周期性潮水浸淹，是以红树植物为主体的木本植物群落，主要分布在南北纬30度之间［3］，是热带、亚热带海岸地带重要的湿地类型，同时也是陆地向海洋过渡的特殊生态系统。该生境具有强还原性、强酸性、高含盐量、营养丰富等特征，蕴藏着丰富且独特的微生物资源。从红树林底泥中分离的放线菌，可产生许多重要的次生代谢产物，目前研究主要集中于抗菌、抗肿瘤活性，在抗根结线虫方面，国内外研究不多。本研究从红树林这一特殊的生态系统中采集样品，分离筛选具有杀线虫活性的放线菌资源，并对活性菌株进行分类鉴定，为开发新型杀虫药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集于2010年4月从海南省东寨港红树林采集土壤样品，带回实验室自然风干，备用。

1.1.2 培养基［4］放线菌分离培养基:高氏一号合成培养基、腐植酸-维生素培养基、1/10 ATCC培养基、酵母粉-淀粉发酵培养基;形态特征鉴定培养基:高氏一号合成培养基、酵母粉-淀粉培养基、无机盐淀粉培养基、甘油天门冬素培养基、燕麦汁培养基和土豆汁培养基;液体发酵培养基:玉米粉1.0%、酵母粉0.1%、黄豆粉1.0%、淀粉0.5%、KH2PO40.05%(黄豆粉和玉米粉煮沸过滤，取汁)，pH 7.2。以上培养基均用陈海水配制。

1.2 方法

1.2.1 放线菌的分离取5 g样品溶于45 mL无菌陈海水，28℃，180 r/min振荡30 min制成土壤悬液。用无菌陈海水分别稀释至10－2、10－3倍，涂布到放线菌分离培养基上，28℃培养，待长出菌落后，挑取培养基上的放线菌于高氏一号培养基上划线分离，得到纯培养。

1.2.2 菌株的发酵培养挑取纯化后的放线菌单菌落，接种于发酵培养基，28℃、180 r/min摇床培养7 d，10 000 r/min离心10 min，备用。

1.2.3 抗根结线虫放线菌的筛选①供试线虫:供试线虫的培养参照雷敬超［5］的方法进行。初筛时使用松材线虫，采用镰刀菌培养;复筛时使用根结线虫，是将含有大量卵块的胡椒根冲洗干净，挑取卵块，28℃孵化所得;②初筛:采用24孔板液体筛选模型［6］。在24孔板中分别加入50 μL发酵液，550 μL无菌蒸馏水，约400 μL(约200条)松材线虫混悬液，混合均匀，28℃放置24 h后用倒置显微镜观察，僵直或卷曲不动的虫体视为被击倒，以发酵培养基为对照，每处理重复3次，计算线虫校正击倒率。向24孔板中加入清水，观察恢复情况，不能恢复活性的记为死亡，计算校正死亡率。校正击倒率(%)=100×(处理击倒率－对照击倒率)/(1－对照击倒率)，校正死亡率(%)=校正击倒率×(1－恢复率);③复筛:采用根结线虫，对初筛中校正死亡率50%以上的菌株按照②方法进行复筛，同时对活性菌株发酵液进行不同作用时间的抗线虫活性测试;④菌株HA11090遗传稳定性测定:高效稳定的杀虫微生物是进一步研究开发利用的前提和基础［7］，本研究将菌株HA11090连续继代培养5代，再按照②的方法测定每代菌株发酵液对根结线虫的校正死亡率。

1.2.4 活性菌株的分类鉴定①形态特征:采用平皿插片法［8］培养放线菌，显微镜下观察活性菌株的菌丝及孢子特征;②培养特征:将菌株接种于放线菌形态特征鉴定培养基上，28℃培养1～2周，观察菌株基内菌丝、气生菌丝的形态特征，有无色素产生等;③生理生化特征:生理生化特征鉴定参照Lechevalier等［9］的方法进行;④16S rDNA序列测定:采用苯酚氯仿法［10］提取放线菌的基因组DNA。以提取的放线菌DNA作为模板，用放线菌通用引物27f(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492r(GGTTACCTTGTTACGACTT)对菌株的16S rDNA片段进行扩增。PCR反应条件:94℃5 min;94℃1 min，55℃30 s，72℃1 min，30个循环，72℃10 min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后送生工生物工程(上海)有限公司测序;⑤16S rDNA序列系统发育树的构建［11］:将菌株的核苷酸序列提交至EzTaxon核苷酸序列库进行比对。利用ClustalX(Version1.8)和MEGA4.0软件进行多序列比对，用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 红树林放线菌的分离与筛选结果

本研究从红树林土壤样品中共分离206株形态特征各不相同的放线菌。初筛获得28株线虫校正死亡率在50%以上的菌株，占供试菌株的13.6%;复筛获得3株线虫校正死亡率在65.0%以上的菌株，其中菌株HA11090线虫校正死亡率为70.5%。菌株HA11090发酵液处理不同时间的抗线虫活性结果见图1，可以看出，线虫的校正击倒率和校正死亡率随着时间的延长而逐渐增大。对菌株HA11090连续进行5次继代培养，结果表明，其产生抗线虫活性物质的遗传性保持稳定。因此，将菌株HA11090作为进一步研究的对象。

图1 菌株HA11090发酵液对线虫校正击倒率及校正死亡率的时间变化曲线Fig.1 Time curve of revised knockdown rate and revised mortality of strain HA11090 fermentation broth

2.2 活性菌株HA11090的鉴定

图2 菌株HA11090的孢子形态Fig.2 Scanning electron micrograph of strain HA11090 grown on Gauze’s No.1 agar

2.2.1 形态特征菌株HA11090在燕麦汁、酵母粉-淀粉、土豆汁、甘油天门冬素、高氏一号、无机盐-淀粉等6种固体培养基上均生长良好，能形成丰富的基内菌丝和气生菌丝，气丝白色，基丝白色至粉红色，在6种培养基上均发现有黄色至棕褐色的可溶性色素产生。扫描电镜下可看出菌株HA11090孢子丝直或弯曲，孢子卵圆形、表面光滑、有毛发(图2)。

2.2.2 生理生化鉴定菌株HA11090能利用果糖、葡萄糖、甘露醇、棉子糖、蔗糖，产生H2S，淀粉水解，硝酸盐还原，明胶不液化，牛奶既能凝固也能胨化，不产生黑色素，生长温度范围为15～45℃，具体情况参见表1。

表1 菌株HA11090的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain HA11090

2.2.3 16S rDNA序列测定及系统发育分析经测序获得菌株HA11090的16S rDNA近全序列1 393 bp。经过相似性比对分析，可发现与菌株HA11090同源性高的菌株都为糖多孢菌属。同源性最高的为Saccharopolyspora hirsuta subsp.kobensis JCM 9109T(99.35%)，其次为Saccharopolyspora jiangxiensis W12T(99.27%)，根据序列同源性从高到低的顺序选取7株模式菌株，利用ClustalX(Version1.8)和Mega4.0软件构建系统发育树。由图3可知，菌株HA11090与S.hirsuta subsp.kobensis和S.Jiangxiensisza在发育树上处于同一个大的分支，亲缘关系最近。

2.2.4 菌株HA11090的鉴定结果菌株HA11090与S.hirsuta subsp.kobensis［12］和S.jiangxiensis［13］的相似性最高，且发育树上处于同一个分支。在形态和生理生化特征方面，菌株HA11090与S.jiangxiensis基本一致，差别仅在于:菌株HA11090不能利用D-木糖、L-肌醇、L-阿拉伯糖;S.hirsuta subsp.kobensis孢子表面粗糙，形成长的孢子链，不产生H2S，而菌株HA11090孢子卵圆形、表面光滑、有毛发，二者差异显著。综合分析，将菌株HA11090鉴定为S.jiangxiensis。

图3 基于16S rDNA的菌株HA11090与相关菌株的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain HA11090 and related strains based on 16S rDNA

3 讨论

在筛选中，采用松材线虫作为初筛线虫，主要是考虑到松材线虫的培养技术较为成熟，以镰刀菌培养线虫，线虫4～5 d就可以繁殖一代，而且雌虫可以连续29次产卵［14］，可以在较短时间内获得大量供试线虫，满足筛选工作对线虫的大量需求。活性检测时，将菌株发酵液稀释20倍，是因为菌株HA11090分离自红树林区域，发酵时培养基用海水配制。为避免高浓度无机盐对线虫的伤害，经反复实验发现，培养基在稀释20倍后可消除对线虫的影响。

16S rDNA序列分析的系统发育学和表型特征存在较好的相关性［15］，通过16S rDNA序列同源性分析与生理生化试验相结合是一种比较快速准确的方法［16］，越来越广泛地应用于细菌分类。本研究结合该方法，将菌株HA11090鉴定为S.jiangxiensis。菌株HA11090发酵液稀释20倍和40倍后，线虫校正死亡率分别为70.5%和65.0%，线虫的校正击倒率和校正死亡率随着时间的延长而逐渐增大，且菌株HA11090抗根结线虫活性稳定。目前对于该菌株，文献上只有一些分类鉴定上的报道，而具有抗根结线虫活性，本文尚属首次报道。

［1］ 汪来发，杨宝君，李传道.根结线虫生物防治研究进展［J］.南京林业大学学报，2002，26(1):64-68.

［2］ 杨宝君，曾大鹏.植物根结线虫生物学、分类鉴定和防治［M］.北京:科学出版社，1983.

［3］ Spald M D，Blasco F，Field C.World Mangrove Atlas［M］.Okinawa:World Conservation Monitoring Centre，1997.

［4］ Mincer TJ，Jensen PR，Kauffman CA，et al.Widespread and persistent populations of a major new marine actinomycete taxon in ocean sediments［J］.Appl.Environ.Microbiol，2002，68(1):5005-5011.

［5］ 雷敬超.杀线虫海洋放线菌的筛选及菌株HA110711的分类鉴定［D］.华南热带农业大学硕士学位论文，2007.

［6］ 雷敬超，李传浩，黄惠琴，等.杀线虫海洋放线菌的筛选及菌株HA07011的鉴定［J］.生物技术通报，2007，(6):147-149.

［7］ 段玉玺.植物线虫病害防治［M］.北京:中国农业科学技术出版社，2002.

［8］ 钱存柔，黄仪秀.微生物学实验教程［M］.北京:北京大学出版社，1999:24.

［9］ Lechevalier M P，Lechevalier H A.The Chemotaxonomy in Actinomycete Taxonomy［M］.Arlington:Society for Industrial Microbiology，1980.

［10］ Xu XH，Wu M，Cao Y，et al.Isolation and phylogenetic analysis of halophilic archaea A J6［J］.J Zhejiang Univ，SciEd，2005，32(1):83-88.

［11］ BAI Xue-dong，WU Min，LI Sui-yan.Seperation and identification of a Novel Halophile［J］.Natural Product Research and Development，2011，23(1):6-9.

［12］ Li-Jie Yuan，Yu-Qin Zhang，Yan Guan，et al.Saccharopolyspora antimicrobica sp.nov.，an actinomycete from soil［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2008，58(5):1180-1185.

［13］ Jianli Zhang，Dongdong Wu，Zhiheng Liu.Saccharopolyspora jiangxiensis sp.nov.，isolated.from grass-field soil［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2009，59(5):1076-1081.

［14］ 刘维志.植物病原线虫学［M］.北京:中国农业出版社，2000:56-58.

［15］ Vandamme P，Pot B，Gillis M.Polyghasic taxonomy，a consensus approach to bacterial systematics［J］.Microbiol Rev，1996，60(2):407-438.

［16］ Weissburg WG，Barns SM，Pelletier DA，et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogebtic study［J］.J Bacterial，1991，173(2):697-703.