鸡耳蜗EFNA2基因RNAi慢病毒载体的构建及其靶基因离体沉默效率*

余佳 向明亮 吴皓 沈晨凌

研究表明，鸟耳蜗毛细胞损伤后能够完全再生、重获神经再支配并完成神经再支配的重塑[1,2]，随着鸡耳蜗毛细胞及其神经支配形态的恢复，其听功能亦得以明显恢复[3]。进一步的研究发现，ephrinA2在鸡卡那霉素中毒后耳蜗毛细胞神经连接的再生及重塑过程中可能起重要作用[4,5]。慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体，与化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA) 以及基于瞬时表达载体构建的短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA) 相比，它可以转染后两者难以转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，提高siRNA的转染效率；此外，病毒携带的基因片段尚能够整合至靶细胞基因组，提供长期稳定的siRNA表达，沉默靶基因[6]。为研究ephrinA2在鸡卡那霉素中毒后耳蜗毛细胞神经连接的再生及重塑过程中的作用及作用机制，本研究拟构建编码ephrinA2蛋白的EFNA2基因的RNA干扰(RNA interference，RNAi)慢病毒载体,并在离体培养的原代鸡听神经细胞中验证其靶基因沉默效率，为后续在体实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验材料 健康纯种、出生10～16 d罗曼鸡10只，雌雄不拘(由上海归兴种鸡厂提供)。病毒载体系统pFU-GW-iRNA(上海吉凯基因有限公司)，293T细胞株(中科院上海细胞所)，Lipofectamine 2000转染试剂(Invirtrogen)，限制性内切酶和T4 DNA连接酶(NEB)，Taq酶(TaKaRa)，质粒DNA提取试剂盒(Qiagen)，SYBR Real-time PCR试剂盒(TaKaRa)。DMEM/F12、胎牛血清、胰酶、D-hanks液、B-27神经生长因子(Gibco),多聚赖氨酸(上海碧云天生物技术有限公司),鼠抗GFP抗体、鼠抗GAPDH抗体、羊抗鼠IgG抗体(Santa Cruz公司)。

1.2实验方法

1.2.1EFNA2 RNAi慢病毒表达载体的构建 针对目的基因EFNA2(GeneBank：NM_204983 大小603 bp )的基因序列，按照RNA干扰序列的设计原则，设计、合成4个siRNA的寡核苷酸序列(KD-1、2、3、4，表1),并进行慢病毒载体的构建(双链DNA具体序列见表2)。然后运用T4连接酶与经过限制性内切酶Hpa I、Xho I双酶切后的pFU-GW-iRNA载体连接。用氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，转化大肠杆菌菌株,最后挑取阳性克隆进行PCR鉴定并进行测序分析。PCR鉴定阳性克隆的引物信息如下：Up (+) 5′- GCC CCG GTT AAT TTG CAT AT -3′; Down (-) 5′- GAG GCC AGA TCT TGG GTG -3′。

表1 siRNA序列信息

表2 siRNA病毒载体构建框架

1.2.2EFNA2过表达载体的构建 为后续外源筛靶的需要，同时构建EFNA2 过表达载体，具体方法如下：从含有目的基因EFNA2的质粒克隆模板中，利用PCR方法扩增目的基因，将PCR产物连接入Age I酶切后线性化pGC-FU 载体慢病毒载体中，纯化酶切产物后进行定向连接、转化，挑取菌落进行PCR鉴定并提取重组质粒及测序鉴定，将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提。

1.2.3EFNA2-RNAi干扰有效靶点的筛选 转染前一天将293T细胞按5×104个/ml 接种于24 孔板中，待其生长达80%～90%融合时，按照下述实验方案进行293T细胞转染：实验分成2大组，每孔分别使用0.25 μg和0.5 μg的干扰质粒,每大组分为6小组：EFNA2的过表达质粒(均为0.5 μg)与含有针对EFNA2的不同干扰靶点序列的RNAi病毒载体质粒混合，记为KD1～4组(干扰组1～4)；与RNAi空载质粒混合记为MOCK组(转染试剂对照组)；与RNAi阴性对照病毒载体质粒混合记为NC组(阴性对照组)。同时设定不转染任何质粒的293T细胞组记为CON组(空白对照组)。把质粒 DNA 与Lipofectamine 2000 (2 μl)的混合液加入293T 细胞中，37 ℃ 5% CO2培养箱中培养6～8 h，换成新鲜的含10%血清的完全培养液。转染后24 h荧光显微镜下观察预估转染率，转染率高于70%时，转染后 36～48 h收集细胞，抽提总蛋白进行Western blot 检测，进而判断不同靶点的干扰效果，否则重新转染。

1.2.4慢病毒颗粒的包装和滴度测定 对含有效干扰靶点的shRNA进行慢病毒颗粒的包装，将重组慢病毒pFU-GW-GFP载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0及pHelper2.0按Lipofectamine 2000 使用说明进行共转染293T 细胞，转染后8 h 更换为完全培养基，培养48 h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，将浓缩后得到的高滴度的慢病毒浓缩液，在293T 细胞中测定并标定病毒滴度，分装后保存在病毒管中，-80 ℃长期保存。病毒浓缩液采用10倍逐孔稀释滴度(10～10-6μl，8个梯度)测定法转染293T细胞，继续培养48 h后通过慢病毒载体上的GFP荧光来测定和计算病毒滴度。

1.2.5原代鸡听神经细胞的制备 将已麻醉的动物置于超净台上，解剖显微镜下解剖分离采取听神经组织，置入预冷的D-HANKS液中，将听神经组织置入0.25%胰酶和0.1%DNA酶中37 ℃下水浴消化30 min，酶解后加入含有血清的DMEM/F12培养液终止消化并离心(5 min，300 g)，弃上清并加入2 ml终溶液(无血清的DMEM/F12培养液+2%B27神经生长因子+双抗)[7]，使用已消毒过火的玻璃滴管反复轻柔吹打组织进一步游离细胞，置于冰上静置数分钟后吸取上清液即获得听神经细胞悬液，反复上述操作，直至组织吹打成絮状[8]。将收集的细胞悬液按1×106/孔细胞接种于已使用多聚赖氨酸包被的12孔板中，置于37 ℃ 5% CO2全自动恒温孵箱中静置培养,根据pH值及细胞生长情况更换培养液，待细胞融合度达到30%时转染病毒。

1.2.6EFNA2 RNAi慢病毒感染原代鸡听神经细胞 实验分为5组：CON(空白对照组)为正常目的细胞且未感染任何病毒的细胞组，NC(阴性对照组)为正常目的细胞但加阴性对照病毒感染的细胞组，KD1～3(干扰组1～3)为正常目的细胞加有RNAi靶点病毒感染的细胞组，1～3表示待筛选靶点病毒的序号。按实验设计的分组情况加入感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1的RNAi慢病毒颗粒进行感染实验。感染72 h后采用荧光显微镜观察慢病毒RNAi质粒上报告基因GFP的表达(绿色荧光)，感染效率需达80%以上，否则重新感染。

1.2.7Quantative Real-time PCR法检测EFNA2基因mRNA的表达 转染后5 d收集感染效率达80%以上的细胞，使用Trizol按说明抽提总RNA，然后根据TAKARA反转录试剂盒的操作说明将RNA逆转录成cDNA。取 2 μl作为模板进行PCR反应，EFNA2上游引物：5'- CCC TGA ACG TGG TGG ACA GA- 3'；下游引物：5'- GCA CGA GTT GTT GCT GGT GAA- 3'。β-actin 作为内参对目的基因EFNA2进行标准化，β-actin 上游引物：5'- AAA TAA AGC CAT GCC AAT CTC GTC- 3'；下游引物：5'- ATT GTC CAC CGC AAA TGC TTC- 3'。PCR反应条件：预变性950C、15 s之后每一步变性950C、5 s，退火延伸600C、34 s；共进行40个循环，每次在延伸阶段读取吸光度值。Real-time PCR数值分析采用2-ΔΔCt分析法。

1.2.8统计学方法 采用SAS 9.13软件统计包对数据进行统计学分析，具体方法为参数统计ANOVA检验法。

2 结果

2.1阳性克隆的PCR鉴定 含有正确插入RNA干扰慢病毒载体(virus-induced short-hairpin RNA，vshRNA)片段的重组克隆的PCR产物343 bp，未连接vshRNA片段的空载体PCR片段大小为299 bp，可见4种质粒均有4个克隆含有正确插入的片段(图1)，PCR鉴定为阳性的克隆，证明shRNA已经定向连入pFU-GW-iRNA表达载体，选取连接成功的克隆测序，测序结果表明合成的EFNA2 shRNA寡核苷酸链序列插入正确，shRNA慢病毒表达载体构建成功。

图1 siRNA慢病毒表达质粒的PCR鉴定

2.2EFNA2基因的过表达载体pGC-FU-EFNA2-GFP的鉴定 对长出的克隆先进行PCR鉴定，菌落PCR显示从重组质粒中可扩增出大小约807 bp的目的条带(图2)，可见8个克隆中有4个为阳性克隆(EFNA2-2,4,6,8),用启动子引物进行测序，测序结果证实已将EFNA2基因编码框正确插入pGC-FU载体的多克隆位点(MCS),pGC-FU-EFNA2-GFP重组质粒构建成功。

图2 EFNA2基因过表达融合蛋白载体pGC-FU-ELF-1-GFP PCR阳性克隆鉴定

2.3Western blot外源筛选靶点 使用凝胶图像处理系统对实验结果进行灰度分析(图3)，可以看出KD1、KD2、KD4靶点对目的基因的表达有敲减作用，因而是有效靶点。

图3 Western blot检测293T细胞中ephrinA2蛋白的表达

2.4慢病毒载体的包装及滴度测定 筛选出的3个有效重组载体(KD1、KD2、KD4)与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，48 h后收集病毒粗提液进行浓缩，分别命名为LV-GFP-EFNA2-shRNA-l、LV-GFP-EFNA2-shRNA-2、LV-GFP=EFNA2-shRNA-3，利用孔稀释法分别测定3个靶点的病毒滴度，结果均为2E+9 TU/ml，病毒成功包装,可用于后续研究。

2.5目的细胞EFNA2 RNAi 效果检测 3个不同干扰靶点的病毒分别感染正常目的细胞，转染72小时后，在荧光显微镜下可观察到慢病毒RNAi质粒上GFP(绿色荧光)的表达(表3，图4)。转染5 d后收集目的细胞提取总RNA逆转录，qRT-PCR检测目的细胞中EFNA2 mRNA水平表达的变化情况，结果显示三个干扰靶点均有干扰效果，其干扰效率分别为：LV-GFP-EFNA2-shRNA-1：76.11%, LV-GFP-EFNA2-shRNA-2：61.87%, LV-GFP-EFNA2-shRNA-3：68.44%。

表3 目的细胞转染5 d后EFNA2 mRNA表达水平( (2-ΔΔCt)

注：*与CON组和NC组比较，P< 0.05；CON：未感染慢病毒细胞组；NC：感染阴性对照病毒细胞组；shRNA1：感染LV-GFP-EFNA2-shRNA-1细胞组；shRNA2：感染LV-GFP-EFNA2-shRNA-2细胞组；shRNA3：感染LV-GFP-EFNA2-shRNA-3细胞组

图4 目的细胞EFNA2沉默效果检测

3 讨论

Ephrin作为已知的轴突导向分子之一，与其受体Eph相互作用可影响鸟类耳蜗以及听觉神经系统的发育，在神经末梢准确地投射、定位、支配新生毛细胞的过程中发挥重要作用[9～11]。文献报道，ephrinA2 及其受体EphA3等在胚胎鸡的耳蜗神经节、位听神经末梢组织中均有表达,并且其蛋白表达部位及量的差异，影响胚胎鸡位听神经靶标的选择及其神经末梢的投射[11]。此前的研究[5]进一步显示， ephrinA2在鸡耳蜗毛细胞及其神经支配的损伤修复中可能有着重要作用， Lee亦有相似报道[4]。因此深入研究ephrinA2在鸟类耳蜗毛细胞及其神经支配的再生及重塑中的作用及作用机制将有助于阐明相关形态现象发生的分子基础。

为进一步满足在体动物实验研究的需要，本研究的主要目的为构建包装针对鸡EFNA2基因的RNAi慢病毒载体，并在体外验证其沉默靶基因的效率。根据GeneBank中编码鸡ephrinA2蛋白的EFNA2基因信息，本研究设计合成了4对干扰靶序列，分别与pFU-GW-iRNA载体连接，将连接产物转化到能容许多外源DNA的载体分子通过的大肠杆菌感受态细胞，经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定，测序结果与设计的序列一致，成功构建4对siRNA-EFNA2慢病毒载体。因实验外源筛靶需要，同时构建目的基因过表达载体pGC-FU-EFNA2-GFP，阳性克隆测序序列与标准序列完全一致，说明目的基因已插入到真核表达载体中。siRNA-EFNA2病毒载体与目的基因的表达克隆质粒共转染293T细胞，从Western Blot结果可以看出，在55 KD附近有阳性条带，4个靶点中，KD1、KD2、KD4对目的基因的表达有较为显著的敲减作用。将含有有效干扰靶点的重组载体经包装后病毒滴度达到2.0×109TU/ml，分别命名为LV-GFP-EFNA2-shRNA-l、LV-GFP-EFNA2-shRNA-2、LV-GFP=EFNA2-shRNA-3。3个慢病毒载体分别感染原代鸡听神经细胞后，EFNA2基因表达均显著降低。实验结果表明，本研究构建的鸡EFNA2基因的RNAi慢病毒载体在离体培养的原代鸡听神经细胞中能持续、高效、特异地抑制靶基因EFNA2的表达。本研究为下一步在体研究ephrinA2在鸡卡那霉素中毒后耳蜗毛细胞神经连接的再生及重塑过程中的作用及作用机制奠定了研究基础。

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