金蒿抗流感滴丸对小鼠TNF－α、IL－2和IFN－γ等细胞因子的影响

杨巧丽，顾政一，黄华，刘燕，王雪，姚华，史玉柱

（1石河子大学药学院，石河子832000；2新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐830004）

金蒿抗流感滴丸对小鼠TNF－α、IL－2和IFN－γ等细胞因子的影响

杨巧丽1，2，顾政一2，黄华2，刘燕2，王雪2，姚华2，史玉柱2

（1石河子大学药学院，石河子832000；2新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐830004）

为了观察金蒿抗流感滴丸对小鼠细胞因子的影响，对其灌胃给药7d后采血制备血清，采用ELISA法测定血清中肿瘤坏死因子α（TNF－α）的含量；以ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖，ELISA法测定细胞上清液中白细胞介素2（IL－2）和γ干扰素（IFN－γ）的含量。结果显示：金蒿抗流感滴丸0.05、0.1和0.2（g／kg）／d剂量组及利巴韦林组和复方一枝蒿颗粒组均能显著促进小鼠血清中TNF－α的分泌（P＜0.05）；金蒿抗流感滴丸浓度为78.13～5000 μg／mL，对ConA诱导的小鼠淋巴细胞分泌IFN－γ和IL－2均有一定的促进作用。结论：金蒿抗流感滴丸对TNF－α、IL－2、，IFN－γ等细胞因子的分泌具有一定的调节作用，这可能是其发挥抗流感病毒作用的免疫机理之一。

金蒿抗流感滴丸；ELISA；TNF－α；IL－2；IFN－γ1

目前理想的抗流感病毒药物却很少，因而开发安全、有效、作用明确的抗流感病毒药物就成为中外医药工作者亟待解决的问题。西药中M2蛋白抑制剂金刚烷胺、金刚乙胺在临床应用多年，但耐药病毒株仍然逐年增加。流感病毒神经氨酸酶抑制剂扎米那韦、奥斯他韦（达菲）是近年来被认为较有前景的新药，但临床应用也存在耐药株的问题。干扰素和病毒唑对甲、乙型流感病毒有效，但均有一定副作用；流感疫苗虽较有效，但由于流感病毒抗原的变异性强，应用也受限［1］。而中药因其毒副作用小，药源丰富，价格低廉，其通过调节整体免疫功能抑制病毒复制，阻止病毒病变，改善临床症状，因而近年来其逐渐成为医学研究的热点［2］。目前常用的抗流感病毒中药研究方法大致分为直接抗流感病毒作用研究，包括体外实验法、鸡胚法和整体动物保护法［3－5］以及间接抗流感病毒研究，即抗病毒中药通过调节机体的免疫功能而发挥的抗流感病毒作用。金蒿抗流感滴丸为新疆一枝蒿（Artemsia rupestris L.）和贯叶金丝桃（Hypericum perforatum）两味药材组成的复方制剂，临床上主要用于治疗流行性感冒。本课题组的前期研究显示，其具有一定的抗流感病毒作用和免疫调节作用。

本实验进一步观察金蒿抗流感滴丸对与流感病毒感染密切相关的肿瘤坏死因子α（TNF－α）、白细胞介素2（IL－2）及γ干扰素（IFN－γ）水平的影响，从细胞因子水平探讨金蒿抗流感滴丸抗流感病毒的免疫学机制，旨在为其临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物

受试药物：金蒿抗流感滴丸，棕色滴丸剂（批号090714），由新疆药物研究所药剂室提供，每丸35 mg（相当于药材约0.7g），成人口服每次8丸，每日3次；阳性对照药：复方一枝蒿颗粒，棕色颗粒剂（国药准字Z20026711，10g／袋，批号：10020104），新疆西域药业有限公司。利巴韦林片，白色片剂（规格：100mg，国药准字 H20033538，批号1011022），江西汇仁药业有限公司，用于病毒性呼吸道感染：成人1次0.15g，1日3次，连用7d。

1.1.2 实验试剂

Hank's储备液：KCl 20.0g，KH2PO40.3g，NaCl 40.0g，Na2HPO40.24g，葡萄糖5.0g，Mg－SO4·7H2O 1.0g，CaCl27.0g，酚红0.5g，依次将上述试剂溶于双蒸水并补足至1L，以NaOH（双蒸水配制）调pH至6.7左右，过滤除菌，即为5倍浓缩的储备液。应用时，取1份储备液加4份重蒸水混合成pH 7.2的HBSS液。

RPMI－1640营养液：取 RPMI·1640培养基10.4g，HEPES 5.9g，谷氨酰胺300mg，丙酮酸钠0.11g，NaHCO32.0g溶于重蒸水并补加至1000 mL，以NaHCO3调pH值至7.1左右，再加灭活的NBS（约相当于总体积的10%），以蔡氏滤器滤过除菌，无菌分装，置0～4℃保存。

ConA（批号：C－2010），TBD 公司生产；RPMI1640（批号：1279327），GIBCO公司生产；胎牛血清（批号：100517），浙江杭州生物科技有限公司生产；ELISA试剂盒（R＆D公司）。

1.1.3 实验动物

昆明种小鼠，60只，体重18～22g，雌雄各半，由新疆医科大学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK（新）2003－0001）；BALB／C小鼠，7只，体重20～22g，由新疆实验动物研究中心提供，雌雄兼用（动物合格证号：SYXK（新）2003－0003）；所有动物雌雄分笼常规饲养。

1.1.4 实验器材

BIO－RAD酶标仪（550），日本；苏净安泰超净工作台（SW－CT－2FD），苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；CO2培养箱（BPN－80CRH），上海一恒科学仪器有限公司；湘仪高速台式冷冻离心机（TGL－16M），湖南湘仪实验仪器开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 对正常小鼠血清TNF－α含量的影响［6－7］

取小鼠60只，依体重、性别随机分为对照组，利巴韦林组、复方一枝蒿颗粒组和金蒿抗流感滴丸小剂量组（0.05（g／kg）／d）、中剂量组（0.05 （g／kg）／d）和大剂量组（0.05（g／kg）／d）三个剂量的给药组。对照组ig等体积蒸馏水，其余各组ig给药，连续7 d，于末次给药后2h采血制备血清。按ELISA试剂盒说明书中的操作测定血清中TNF－α的含量。

1.2.2 对ConA诱导小鼠淋巴细胞上清IL－2和IFN－γ含量的影响［6－9］

1.2.2.1 小鼠脾细胞悬液制备

脱颈椎处死BALB／C小鼠，用75%的酒精浸泡消毒30min，无菌条件下取出脾脏，放入盛有适量无菌Hank′s液的小平皿中稍清洗，转移至下方盛有适量冷Hank′s液小培养皿的100目不锈钢网筛中，用眼科剪将脾脏充分剪碎，Hank′s液冲洗过滤制成单个细胞悬液，细胞悬液转移至离心管内，1000 r／min，离心10min，弃上清，离心管中加入适量0.83%NH4Cl，静置低渗处理3min，除去红细胞，1000r／min离心5min，弃上清液，完全培养液清洗沉淀3次（1000r／min，离心10min），以台盼蓝排除法计数活细胞数在95%以上。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液，将细胞浓度调至2.0×106／mL。

1.2.2.2 IFN－γ和IL－2的诱生与测定

取上述脾淋巴细胞悬液（2.0×106／mL）接种于96孔细胞培养板中，每孔150.0μL；加入50.0μL ConA，使ConA终浓度为10.0μg／mL；再分别加入经免疫学预实验确定的不同浓度金蒿抗流感滴丸（浓 度 梯 度 分 别 为：5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.13μg／mL），复方一枝蒿颗粒（浓度梯度分别为：15000、7500、3750、875、937.5、468.75、234.38μg／mL）和利巴韦林片（浓度梯度分别为：200、100、50、25、12.5、6.25、3.13μg／mL）溶液各50.0μL，ConA对照组加入RBMI 1640液50μL，试验组和对照组均设3个平行孔。然后将96孔培养板置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养48h后，吸取上清，3000r／min，离心10min，获上清液，分别采用双抗体夹心ELISA法检测各孔中IL－2和IFN－γ含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 对正常小鼠血清TNF－α含量的影响

各给药组小鼠血清中TNF－α含量数值经对数转换后，各组间进行单因素方差分析，统计结果见表1。表1表明：与正常对照组比较，金蒿抗流感滴丸0.05、0.1、0.2（mg／kg）／d剂量组及阳性对照利巴韦林组和复方一枝蒿颗粒组小鼠血清中TNF－α含量均有显著提高（P＜0.05）。

表1 金蒿抗流感滴丸对小鼠血清中TNF－α水平的影响（，n＝10）Tab.1Effect of Jinhao anti－flu pills treatment on the TNF－αlevel in serum of mice

表1 金蒿抗流感滴丸对小鼠血清中TNF－α水平的影响（，n＝10）Tab.1Effect of Jinhao anti－flu pills treatment on the TNF－αlevel in serum of mice

注：F＝14.918，P＝0.000＜0.01；与正常对照组比较，＊表示P＜0.05，＊＊表示P＜0.01。

别 剂量／（（g／kg）／d） 动物数量 TNFα含量／（pg／mL）

2.2 对ConA诱导BALB／C小鼠淋巴细胞上清中IL－2和IFN－γ含量的影响

表2显示，与ConA对照组比较，阳性对照组利巴韦林片在20.00～3.13μg／mL浓度和复方一枝蒿颗粒在15000.00～234.38μg／mL浓度对小鼠淋巴细胞上清液中IL－2和IFN－γ的生成均有一定促进作用，其中复方一枝蒿颗粒3750μg／mL浓度可以显著促进小鼠淋巴细胞上清液中IFN－γ的生成（P＜0.05）；金蒿抗流感滴丸在5000.00～78.13 μg／mL浓度对ConA诱导小鼠淋巴细胞上清液中IL－2和IFN－γ的生成均有一定促进作用，其中78.13μg／mL浓度对ConA诱导小鼠淋巴细胞上清液中IL－2的生成有显著促进作用（P＜0.05），2500、1250、625μg／mL浓度对小鼠淋巴细胞上清液中IFN－γ的生成有显著的促进作用（P＜0.05）。

表2 金蒿抗流感滴丸对ConA诱导BALB／C小鼠淋巴细胞生成IFN－γ和IL－2水平的影响（，n＝10）Tab.1Effect of Jinhao anti－flu pills treatment on the level of IFN－γand IL－2in the serum of ConA－amplified spleen lymphocytes of BALB／C mice

表2 金蒿抗流感滴丸对ConA诱导BALB／C小鼠淋巴细胞生成IFN－γ和IL－2水平的影响（，n＝10）Tab.1Effect of Jinhao anti－flu pills treatment on the level of IFN－γand IL－2in the serum of ConA－amplified spleen lymphocytes of BALB／C mice

组别 样品浓度／（μg／mL） IL－2含量／（pg／mL） IFN－γ含量／（pg／mL）654.06±176.64 1364.83±80.83利巴韦林片 200.00 651.83±135.00 1463.17±79.74 100.00 745.17±64.96 1551.5±172.99 50.00 708.50±44.85 1399.83±103.00 25.00 757.39±22.63 1551.5±100.37 12.50 759.06±27.76 1318.17±116.23 6.25 801.83±75.35 1363.17±316.08 ConA组 －3.13 762.39±120.39 1446.5±206.22

续表2

3 讨论

TNF－α是一种重要的细胞因子。在病毒诱导的细胞因子释放及在抗病毒感染中，TNF－α起着重要的作用［10－11］。

IL－2主要由CD4＋ T细胞产生，此外CD8＋细胞和NK细胞也可产生。在小鼠，主要由Th1亚群产生，IL－2本身无直接抗病毒作用，其能够刺激T细胞产生多种淋巴因子，诱导CTL、NK、LAK等多种杀伤细胞的分化和效应功能，诱导杀伤细胞产生IFN－γ等细胞因子，而起到抗病毒作用。IFN－γ主要由T细胞和自然杀伤细胞所产生，它主要与免疫调节有关［12］，如诱导巨噬细胞、B细胞的抗原呈递能力，活化NK细胞，提高其杀伤能力，活化的NK细胞又能分泌IFN－γ，从而使机体内的NK细胞、IFN－γ和IL－2相互作用，形成免疫网络，增强机体抗病毒和免疫调节作用。

本实验观察了金蒿抗流感滴丸对细胞因子的影响，结果显示，金蒿抗流感滴丸能够促进血清中TNF－α含量，同时对细胞中IL－2和IFN－γ的生成有一定促进作用。TNF－α、IL－2和IFN－γ等细胞因子在机体内相互作用，在抗病毒和免疫调节作用中发挥着重要作用。本实验研究从分子水平揭示了该药对小鼠 TNF－α、IL－2 和IFN－γ等细胞因子的影响，为其进一步揭示该药抗流感病毒作用的免疫机理奠定了一定的实验基础。

［1］刘春宇.抗流行性感冒病毒药物研究综述［J］.中国医药指南，2009，7（11）：205－206.

［2］陈敏，王飞，谭万初.中医药抗病毒感染的实验研究进展［J］.中华实用中西医杂志，2007，20（4）：341－344.

［3］Ma C M，Nakamura N，Hattori M.Inhibitory effects on HIV－l protease of trip－coumaroy lspermidine from Artemisia caruifolia and related amides［J］.Chem Pharm Bull（Tokyo），2001，49（7）：915－917.

［4］Duan H，Takaishi Y，Imakura Y，et a1.Sesquiterpene alkaloids from Tripterygium hypoglaucum and Tripterygium wilfordii：a newclass of potent anti－HIV agents［J］.J Nat Prod，2000，63（3）：357－361.

［5］Su M，Ji Y，Leung K T，et al.Antiviral activity and constituentof Ardisia chinensis benth against coxsackie B3 virus［J］.Phytother Res，2006，20（8）：634－637.

［6］金丽琴，薛胜霞，吕建新，等.牛膝多糖衍生物对小鼠脾淋巴多糖增殖及诱生IL－2和TNF－α的影响［J］.中国生化药物杂志，2008，29（5）：312－314.

［7］龚婕宁，张庆宏，郭海，等.苍果喷雾剂对流感病毒感染小鼠抗病毒免疫的影响［J］.中药药理与临床，2008，24（6）：68－69.

［8］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1440－1441.

［9］徐艳，郑永唐，何黎，等.昆明山海棠片对小鼠淋巴细胞体外增殖活化影响的研究［J］.中药材，2008，31（4）：557－561.

［10］樊万虎，张成文.肿瘤坏死因子与病毒性疾病［J］.中华实验临床免疫学杂志，1993，5（3）：47－49.

［11］黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术［M］.北京：科学出版社，1990：56－58.

［12］陈鸿珊，张兴权.抗病毒药物及其研究方法［M］.北京：化学工业出版社，2006：36－44.

Effect of Jinhao Anti－Flu Pills on Cytokines of TNF－α，IL－2 and IFN－γin Mice

YANG Qiaoli1，2，GU Zhengyi2，HUANG Hua2，LIU Yan2，WANG Xue2，YAO Hua2，SHI Yuzhu2
（1School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2Xinjiang Institute of Meteria Medica，Urumqi 830004，China）

The objective of this study was to observe the effect of Jinhao anti－flu pills on the cytokines of mice.Tumor necrosis factorα（TNF－α）in the serum was measured by ELISA method after serum preparation using the blood sampled from the mice which were gavaged for seven days.Spleen lymphocytes were amplified under the ConA induction.Interleucocyte 2（IL－2）and γInterferon（IFN－γ）in the supernatant fluid were measured by the ELISA method.The results showed that dosage groups of 0.05，0.1and 0.2（g／kg）／d of Jinhao anti－flu pills，Ribavirin group，and compound Artemisiae rupestris granules group all significantly promoted the secretion of TNF－αin the mouse serum （P＜0.05）.Jinhao anti－flu pills in the concentration range of 78.13～5000μg／mL could promote ConA－induced secretion of IFN－γand IL－2from the lymphocytes of mice.Conclusion：Jinhao anti－flu pills have a certain regulating effect on the secretion of such cytokines as TNF－α，IFN－γ，IL－2，which may be one of the immunity mechanisms of its anti－influenza function.

Jinhao anti－flu pills；ELISA；TNF－α；IL－2；IFN－γ

R286；R285.5

A

1007－7383（2012）01－0056－04

2011－10－10

国家十二五重大药物创制项目（2011ZX09102－009－07）

杨巧丽（1979－），女，硕士生，助理研究员，专业方向为药物新制剂与新剂型；e－mail：qiaoliyang1006＠yahoo.com.cn。

顾政一（1957－），男，研究员，从事药物新制剂与新剂型研究；e－mail：qiaoliyang1006＠yahoo.com.cn。