心肌保护药物35S－SPRC的制备及其生物分布定量研究

沈海星 张金莲 孙 丽 朱建华△

（1复旦大学药学院智能化递药教育部和全军重点实验室 上海 201203；2上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心 上海 201203）

S－炔 丙 基 半 胱 氨 酸 （S－propargyl－cysteine，SPRC）是大蒜有机硫化合物的类似物，作为一种新型的心脏保护剂应用于临床前研究。现有研究显示SPRC对心肌细胞损伤有保护作用，SPRC可介导内源性H2S生成，抑制心肌细胞凋亡和心室重构，对心肌梗死后心力衰竭的发生有治疗作用［1－3］。SPRC的紫外吸收和荧光性质均很弱，且内源性的物质氨基酸类化合物与之相似，若用常规分析方法检测SPRC在生物体内的含量，其灵敏度一般难以达到研究的要求［4－5］。所以本研究制备了35S－SPRC并将其作为示踪剂，采用放射性核素示踪技术测定35S－SPRC在大鼠体内的生物分布。

材料和方法

试剂与仪器35S－L－半胱氨酸（35S－L－cysteine），Soluene－350（组织消化剂），Ultima－Gold闪烁液（美国PerkinElmer公司）；半胱氨酸［国药集团化学试剂有限公司（上海）］；3－溴丙炔［梯希爱（上海）化成工业发展有限公司］；其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

电子天平（1712型，德国Sartorius公司）；液体闪烁计数器，磷屏仪（美国PerkinElmer公司）；高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）。

非标记SPRC的制备SPRC的合成路线如图1所示。

图1 SPRC的合成路线图Fig 1 Synthesis procedure of SPRC

SPRC的制备参考文献［6］的方法，在装有40mL无水乙醇的干燥烧瓶中加入3．94g金属钠，待钠反应完全后，从中移取2mL液体至干燥的100 mL烧瓶中，向烧瓶中加入121．4mg L－半胱氨酸和4mL无水乙醇，室温搅拌至L－半胱氨酸全部溶解后，向其中逐滴加入500μL 3－溴丙炔，在室温下搅拌0．5h。反应液用2mL 12mol／L HCl溶液中和，减压蒸馏（0．06MPa，60℃）除去过量的3－溴丙炔，再将反应液冷冻干燥，得到152．2mg淡黄色固体，产率95．7%。采用 HPLC法分析SPRC的纯度，色谱条件为：PRP－C18分析柱（4．6mm×250 mm），流动相为0．02%三氟乙酸溶液，流速0．8 mL／min，进样量10μL，检测器为紫外检测器（λ＝214nm）。产物核磁共振和质谱分析结果如下：1HNMR （400MHz，D2O）δ＝4．25（dd，J＝7．8、4．4、1H），3．33－3．23 （m，3H），3．12 （dd，J＝15．2，7．8、1H），2．59 （t，J＝2．5，1H）；MS，m／z：160．1（M＋H），182．1（M＋Na）。

35S－SPRC的放化合成及鉴定放射性标记路线如图2所示。

35S－SPRC 的 制 备将91μL35S－L－半 胱 氨 酸（3．7×107Bq，1．0mCi）和1．1mg的半胱氨酸溶于160μL 25%的C2H5ONa乙醇溶液中，涡旋2min，待固体全部溶解，迅速加入80μL 3－溴丙炔，接着涡旋5 min，中间60℃水浴1min，最后加入160μL 12mol／L HCl溶液终止反应。反应结束后，向反应液中通入N2以除去过量的3－溴丙炔，真空放置过夜［7－9］。

35S－SPRC放化纯度的测定35S－SPRC放化纯度的测定采用硅胶层析法［10］，展开剂为正丁醇∶甲酸∶水＝4∶2∶1。展开后的硅胶板用磷屏仪作放射自显影［8］，35S－L－半胱氨酸与35S－SPRC的Rf值分别为0．534和0．685，与冷实验结果一致，对35S－SPRC的放射自显影图进行定量处理，35S－SPRC放化纯度＞95%。

图2 35S－SPRC放射性标记路线图Fig 2 Route of the radio－labeling of 35S－SPRC

大鼠体内分布将35S－SPRC配制成放射性浓度为9．25×105Bq／mL、比活度为1．96×107Bq／mmol（含7．5mg SPRC）的药液待用。取SD大鼠18只，体重（227±18）g，随机分成3组，每组6只，雌雄兼具，按15mg／kg35S－SPRC的剂量灌胃给药。分别于给药后0．5、1．5及6h各处死1组大鼠，取血浆、心、肺、肝、脾、肾、脑［11］，其中血浆取100μL于闪烁杯中，加入10mL Ultima－Gold闪烁液，混匀待测。其他组织精密称取0．5g，剪碎，加2．0mL超纯水制备成组织匀浆，从中取0．4mL于闪烁杯中，加入1mL Soluene－350组织消化液，于60℃震摇1h，然后加入10mL Ultima－Gold闪烁液，混匀待测。为了消除可能产生的化学发光，所有样本加入闪烁液后均于24h后测量。测得的结果以单位质量组织中的放射性占注入剂量的百分比表示（%ID／g）。

结 果

SPRC的HPLC纯度测定半胱氨酸和产物SPRC的HPLC图谱如图3所示。半胱氨酸的保留时间为2．8min，SPRC的保留时间为3．7min。

图3 半胱氨酸 （A）与SPRC（B）高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatogram of cysteine（A）and SPRC （B）

产物的放化纯度测定及标记方法讨论35S

SPRC放化纯度的测定采用TLC法。展开后的硅胶板用磷屏仪作放射自显影。SPRC的TLC采用碘蒸气显色，其TLC图谱与35S－SPRC的TLC图谱如图4所示（A、B图中的左侧为半胱氨酸或35S－半胱氨酸，右侧 为 SPRC 或35S－SPRC）。35S－L－半 胱 氨酸与35S－SPRC的Rf值分别为0．534和0．685，与冷实验结果一致。对35S－SPRC的放射自显影图进行定量处理［8］，结果见图5（箭头处为35S－SPRC的放射自显影斑点）。根据分析结果计算，35S－SPRC放化纯度＞95%。

图4 SPRC（A，右边）与35S－SPRC（B，右边）的薄层色谱图Fig 4 Thin Layer chromatography of SPRC （A，theright spot）and 35S－SPRC （B，the right spot）

图5 35S－SPRC薄层色谱的放射自显影图的定量分析Fig 5Analysis of autoradiograph on thin Layer chromatography of 35S－SPRCArrow：Autoradiographic spot of 35S－SPRC．

大鼠的体内分布研究根据之前研究得出的血药浓度－时间曲线的变化趋势，选择0．5、1．5和6h3个时相，分别代表吸收、分布和消除相的体内分布。大鼠的体内分布研究（表1）发现，0．5h内化合物在多数脏器达到峰值，然后渐渐下降。分布结果表明，化合物在大鼠体内通过肾代谢，运用35S－SPRC能准确地测得SPRC在大鼠体内的生物分布。

表1 35S－SPRC在大鼠体内的生物分布Tab 1 Biodistribution of 35S－SPRC in the rats（%ID／g，±s，n＝5）

表1 35S－SPRC在大鼠体内的生物分布Tab 1 Biodistribution of 35S－SPRC in the rats（%ID／g，±s，n＝5）

Brain 0．072±0．0100．079±0．0170．046±0．013

讨 论

本文参照文献［6］制备了SPRC，首先改进了SPRC的合成路线，在此基础上以35S－半胱氨酸为起始原料合成得到35S－SPRC，并以35S－SPRC为示踪剂研究了35S－SPRC在SD大鼠体内的生物学分布。影响放射性核素示踪技术灵敏度的重要因素之一是标记物的比活度。在本研究中，由于SPRC的给药剂量较大，检测方法无需高灵敏度，故本实验中试药配制的比活度仅为1．96×107Bq／mmol，即便如此，其灵敏度已足以满足实验的要求。正因为放射性核素示踪技术具有极高的灵敏度，故目前国内外均已将放射性核素示踪技术作为新药研发中药动学研究最重要的方法之一。

［1］ Dongo E，Hoenyak I，Benko Z，etal．The cardioprotective potential of hydrogen sulfide in myocardial ischemia／reperfusion injury ［J］．ActaPhysiolHung，2011，98（4）：369－381．

［2］ Ginter E，Simko V．Garlic （Allium sativum L．）and cardiovascular diseases［J］．BratislLekListy，2010，111（8）：452－456．

［3］ Sen U，Vacek T，Hughes W，etal．Cardioprotective role of sodium thiosulfate on chronic heart failure by modulating endogenous H2S generation［J］．Pharmacology，2008，82（3）：201－213．

［4］ Zheng Y，Liu H，Ma G，etal．Determination of S－propargyl－cysteine in rat plasma by mixed－mode reversedphase and cation－exchange HPLC－MS／MS method and its application to pharmacokinetic studies［J］．JPharm BiomedAnal，2011，54（5）：1187－1191．

［5］ Pan L，Liu X，Gong Q，etal．S－Propargyl－cysteine（SPRC）attenuated lipopolysaccharide－induced inflammatory response in H9c2 cells involved in a hydrogen sulfidedependent mechanism［J］．AminoAcids，2011，41（1）：205－215．

［6］ Wang Q，Liu H，Mu Q，etal．S－propargyl－cysteine protects both adult rathearts and neonatal cardiomyocytes from ischemia／hypoxia injury：the contribution of the hydrogen sulfide－mediated pathway［J］．JCardiovasc Pharmacol，2009，54（2）：139－146．

［7］ 张政伟，钱隽，薛方平，等．葡萄糖转运蛋白显像剂6－（18F）FDG的制备及在小鼠体内的分布［J］．高等学校化学学报，2009，30（12）：2419－2423．

［8］ 李光慧，盛许晶，朱建华．多巴胺 D2受体显像剂125IDMAIBZM的合成及生物分布实验［J］．高等学校化学学报，2010，31（12）：2413－2418．

［9］ 李剑勇，赵宋材，李金善，等．猪血液中14C标记喹烯酮的测定及药代动力学研究［J］．动物医学进展，2003，24（3）：78－79．

［10］ Wright RA，Johnson BG，Zhang C，etal．CNS distribution of metabotropic glutamate 2 and 3 receptors：Transgenic mice and ［（3）H］LY459477 autoradiography［J／OL］．Neuropharmacology，2012（2012－1－13）．http：／／www．science direct．com／sicence／article／pii／s0028390812000391．

［11］ Zhang R，Diasio RB，Lu Z，etal．Pharmacokinetics and tissue distribution in rats of an oligodeoxynucleotide phosphorothioate（GEM91）developed as a therapeutic agent for human immunodeficiency virus type－1［J］．BiochemPharmacol，1995，49（7）：929－939．