FSHR基因Ala307Thr单核苷酸多态性与浆液性卵巢癌易感性的关联

徐 嬿 金鸿雁 李 斌

（复旦大学附属妇产科医院 上海 200011）

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，其发病机制尚不明确。促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）是由腺垂体的促性腺细胞分泌的一种重要的女性促性腺激素，是卵泡发育所必需的激素，在体外也可促进卵巢上皮细胞增殖。近年来的一些研究表明FSH可能作为卵巢癌的生长启动因子之一，促进卵巢癌的发生与发展［1－3］。FSH 促进肿瘤细胞生长的作用有赖于与靶细胞膜上的促卵泡激素受体（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）相结合，经过受体介导从而将信息传递到靶细胞内。研究表明FSHR在相当一部分卵巢癌组织中的确有表达［1－2］，并且其在癌变细胞中的表达水平明显高于正常细胞［4－5］。另外，研究发现FSHR的过度表达，可能会增强潜在的致癌基因途径，并加快癌前病变的卵巢表面上皮的增殖［6］。

FSHR存在多个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点，由第10外显子连锁不平衡所致的多态性中，以Ala307Thr（rs6165）和 Ser680Asn （rs6166）最 为 常 见［7］。 第307位密码子的A→G，导致苏氨酸（threonine，Thr）变为丙氨酸（alanine，Ala），而第680位密码子的G→A，可导致丝氨酸（serine，Ser）变为天冬酰胺（asparagine，Asn）。由于核苷酸的改变而引起其相对应氨基酸发生变化，可能使FSHR蛋白的翻译后修饰受到影响，从而影响其功能。有不少研究认为不同妇女的卵巢对FSH刺激的反应各不相同，可能与 FSHR 的SNP有关［8－10］。

目前对于FSHR基因SNP与卵巢癌发生发展相关性的研究国内外较少见，且结果不一致［11－12］。本研究采用聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性 （polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）分析方法，探讨FSHR基因第10外显子Ala307Thr单核苷酸多态性与浆液性卵巢癌易感性的关系。

材料和方法

研究对象选取2002年1月1日至2006年12月31日在复旦大学附属妇产科医院接受手术治疗的中国汉族浆液性卵巢癌患者48例，年龄为35～75岁，平均年龄为（54．2±8．7）岁。30例正常对照为2011年1至6月同一地区非恶性肿瘤的妇科疾病患者，年龄为42～75岁，平均年龄为（50．5±7．4）岁。两组平均年龄无统计学差异（P＞0．05）。所有卵巢癌患者均经组织病理学诊断为浆液性卵巢癌。浆液性卵巢癌组织从复旦大学附属妇产科医院病理科存档科研蜡块中切取。正常对照组在征得患者本人或其家属同意后，采集外周静脉血3mL。本研究对所有病例组患者的发病年龄、临床病理分期（FIGO）、肿瘤分化程度、初诊时血清CA125水平及盆腔淋巴结转移情况进行病史回顾分析。

基因组DNA的抽提石蜡包埋组织均使用组织DNA抽提试剂盒E．Z．N．A．®Tissue DNA Kit Omega（D3396－01，上海翊圣生物科技有限公司）进行基因组DNA抽提，外周血采用酚／氯仿抽提法提取基因组DNA。抽提获得的DNA经电泳验证。

基因分型采用PCR－RFLP方法对FSHR Ala307Thr基因分型。引物由上海晶鉴实业有限公司 合 成，Ala307Thr 位 点 上 游 引 物：5′－GCTCTGAGCTTCATCCAATTTG－3′，下游引物：5′－CTCTGCTGTAGCTGGACTCATT－3′。 PCR反应体系为20μL，包括10×PCR缓冲液（Mg2＋plus），250mmol／L dNTP，1UTaq DNA 聚 合 酶（TaKaRa），上、下游引物各200nmol／L。PCR 反应条件为：95℃预变性5min后，然后95℃变性30 s、50℃退火30s、72℃延伸30s，40个循环后，72℃继续延伸10min。PCR产物经限制性内切酶AhdI（NEB公司）（0．5μL／25μL）于37℃酶切18h后，进行3．5%琼脂糖凝胶电泳（60mV，30min）。10%样品送上海基康生物技术有限公司进行直接测序。

统计学分析 数据统计分析采用SPSS13．0版软件包（SPSS Company，Chicago，Illinois，USA）。比较两组平均年龄采用t检验。采用Hardy－Weinberg 平 衡 （Hardy－Weinberg Equilibrium，HWE）分析确认研究样本的群体代表性。基因型分布比较采用χ2检验及行×列表确切概率法检验。以非条件二分类Logistic回归法计算经年龄调整后P值及相对风险度的比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）。

结 果

FSHR Ala307Thr基因分型结果Thr／Thr基因型经AhdI酶切后产生70bp、31bp和19bp 3条片段，Ala／Ala基因型经酶切后产生101bp、19bp 2条片段，Ala／Thr基因型则显示为101bp、70bp、31 bp和19bp 4条片段（图1）。直接测序结果与PCR－RFLP的结果一致（图2）。

图1 Ala307Thr单核苷酸多态性PCR－RFLP基因分型结果Fig 1 PCR－RFLP patterns of SNP Ala307Thr

图2 SNP Ala307Thr直接测序结果Fig 2 Direct sequencing results for SNP Ala307ThrA：Homozygous genotype of A／A corresponds to Thr／Thr；B：Homozygous genotype of G／G corresponds to Ala／Ala；C：Heterozygous genotype of A／G corresponds to Ala／Thr．

Ala307Thr在卵巢癌病例及对照组中的基因型分布FSHR基因第10外显子Ala307Thr在对照组及病例组中的分布均符合Hardy－Weinberg平衡（P＞0．05，表1）。Ala307Thr基因型分布在浆液性卵巢癌患者组与对照组的差异均有统计学意义，经年龄调整后两组的307Ala携带率有显著性差异（P＝0．001），OR 值 为6．525 （95%CI：2．202～19．335），307Ala携带可能增加浆液性卵巢癌的易感性（表1）。

表1 Ala307Thr基因型在对照组和病例组中的比较Tab 1 SNP Ala307Thr genotypes comparison in the case and control groups ［n（%）］

与影响预后的临床因素的相关性 在不同发病年龄、临床病理分期、初诊时血清CA125水平及盆腔淋巴结转移情况中，Ala307Thr的基因型分布均无统计学差异。而在低分化和中高分化浆液性卵巢癌中Ala307Thr的基因型分布具有统计学差异（P＝0．004，表2）。进一步比较不同分化程度的307Ala携带率，低分化组307Ala携带26例（83．9%），中高分化组13例（81．3%），经年龄调整后两组307Ala携带率无明显差异（P＝0．959），OR值为1．045 （95%CI：0．201～5．437）。

表2 Ala307Thr基因型分布在浆液性卵巢癌不同预后相关因素中的比较Tab 2 SNP Ala307Thr genotypes comparison in different factors of prognosis （%，n）

讨 论

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位居女性生殖系统恶性肿瘤之首。浆液性卵巢癌为卵巢癌中最常见的病理类型，约占40%～50%。绝经后妇女的卵巢癌发病率明显高于育龄期妇女，前者内分泌的主要变化是雌激素水平降低和促性腺激素（如FSH）水平升高［13］，研究发现FSH可促进卵巢上皮性肿瘤细胞增殖［1－3］。这些均提示FSH与卵巢癌的发生发展相关。

不同妇女的卵巢对FSH刺激的反应各不相同，可能与FSHR基因单核苷酸多态性有关。针对接受控制性超促排卵治疗妇女的研究中发现，Ala／Ala基因型对于FSH的敏感性高于Ala／Thr及Thr／Thr基因型，该基因型个体在低剂量FSH的刺激下，即可诱发排卵，并且其发生卵巢过度刺激综合征的风险高于其他两种基因型［8］。而针对单体型的研究中，Simoni等［9］则认为 FSHR 的 Ala307－Ser680似乎与基础FSH水平明显升高相关。国内研究结果也认为FSHR基因Ala307Thr和Ser680Asn的多态性可能与卵巢反应性有关［10］。这些研究均提示FSHR基因单核苷酸多态性可能会影响卵巢对FSH的反应，但其机制尚不明确。

目前关于FSHR基因Ala307Thr和Ser680Asn的单核苷酸多态性与卵巢癌发病风险的研究较少，且结果不一致。我国香港学者Yang等［11］比较了202例卵巢癌患者的卵巢组织与266例非恶性妇科疾病患者的正常卵巢组织，发现FSHR307Ala及680Ser携带者发生浆液性和黏液性卵巢癌的风险显著增加，而发生子宫内膜样卵巢癌及透明细胞卵巢癌的风险并不增加。进一步研究发现卵巢癌不同组织学亚型表现为不同FSHR单核苷酸多态性联合模式，浆液性及黏液性卵巢癌患者中以Thr307－Asn680及Ala307－Ser680为主，且Ala307－Ser680单体型与发生卵巢癌的高风险率有关，尤其是浆液性和黏液性卵巢癌。但德国学者Heubner等［12］的研究结果却与之不同。他们研究了115名上皮性卵巢癌患者及115名健康女性，研究对象均为白种人，认为 Thr307－Asn680、Ala307－Ser680这两种单体型与上皮性卵巢癌的发病风险无关。

本研究对FSHR基因第10外显子Ala307Thr单核苷酸多态性的研究结果显示，其在浆液性卵巢癌患者与正常卵巢女性之间存在显著性统计学差异（P＝0．000 4），且FSHR307Ala携带者浆液性卵巢癌的发生风险明显升高。这与Yang等［11］的研究结果一致。由于本文的研究对象均为中国汉族妇女，Yang等的研究对象为中国香港地区妇女，而Heubner等研究的则为白种人，不同的人种具有不同的遗传学背景，故研究结果的不同可能为人种差异所致。

另外，我们比较了Ala307Thr单核苷酸多态性与一些影响浆液性卵巢癌预后的临床因素之间的相关性。结果显示Ala307Thr与发病年龄、临床病理分期、盆腔淋巴结转移情况、初诊时血清CA125水平均无明显相关性，但本研究发现Ala307Thr的基因型分布在低分化和中高分化浆液性卵巢癌中的分布具有统计学差异（P＝0．004），但进一步比较两组间307Ala携带率，结果显示无明显组间差异，由于本研究的样本量较少，故需扩大样本量进一步了解Ala307Thr与肿瘤分化间的关系。

本研究初步探讨了FSHR第10外显子Ala307Thr单核苷酸多态性与浆液性卵巢癌之间的相关性，发现该位点与浆液性卵巢癌的发病风险相关，307Ala携带可能会增加浆液性卵巢癌的发生风险。有关FSHR基因Ala307Thr单核苷酸多态性与卵巢癌之间关系的研究目前还较少，该位点的单核苷酸多态性与浆液性卵巢癌的易感性及临床预后的相关性，还有待于进一步大样本量下的不同人种间的研究。

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