丹参川芎嗪注射液对TNFα干预血管内皮细胞损伤ET-1和ICAM-1基因表达的影响

汪 伟 吕清国 (长春大学，吉林 长春 30022)

1.4 逆转录反应 按Toyobo逆转录试剂盒使用说明进行操作，逆转录反应条件为 37℃变性15 min，95℃ 5 min。产物－20℃保存或立即进行下一步PCR反应。

1.5 实时定量荧光PCR反应 按照Toyobo SYBR实时PCR试剂盒操作说明，加入 4.8 μl ddH2O、10 μl SYBR、0.6 μl上游引物、0.6 μl下游引物和4 μl cDNA。反应条件为：95℃预变性15 s;95℃ 5 s，60℃ 15s，72℃ 20 s 45 个循环。Roche 480 PCR仪上进行定量分析。以正常对照组作为标准，其他组与其进行比较，换算成百分率。

动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性疾病，各种危险因素引起细胞释放肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素等细胞因子作用在内皮细胞上，内皮素(ET)的分泌增加导致内皮细胞功能受损，内皮细胞上的细胞间黏附因子(ICAM)-1表达增加，导致单核细胞黏附在血管内皮细胞上，进一步的促使AS发生和发展。活血化瘀中药具有抗血管内皮损伤、防治AS的作用〔1〕。采用活血化瘀法干预AS的发生发展能够取得良好的效果〔2〕。丹参川芎嗪注射液是根据中医活血化瘀的原理，以丹参和川芎为主的中草药经过现代科学技术方法加工制成，其主要成分为丹参素和川芎嗪。临床广泛应用于闭塞性脑血管疾病，如脑供血不足、脑血栓形成、脑栓塞及其他缺血性心血管疾病，如冠心病的胸闷、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑卒中、血栓闭塞性脉管炎等的治疗当中。本文采用炎症因子TNF-α干预致人脐静脉内皮细胞ECV304损伤，模拟AS时血管内皮受损的情况，探讨丹参川芎嗪注射液对与内皮细胞功能密切相关的ET-1和ICAM-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 丹参川芎嗪注射液由贵州拜特制药有限公司生产。人脐静脉血管内皮细胞株ECV304购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。RPMI-1640培养基为Gibco公司产品，胎牛血清为 PAA公司产品。TNF-α为 Invitrogen公司产品。TRNzol总RNA提取试剂为Tiangen公司产品。逆转录试剂盒和实时定量荧光PCR试剂盒为Toyobo公司产品。引物由TAKARA公司设计和合成。

1.2 细胞培养 人脐静脉血管内皮细胞ECV304的培养基为RPMI-1640加10%胎牛血清及1%双抗(10 000 U/ml青霉素、10 000 μg/ml链霉素)，在 37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养、传代，以备实验使用。

1.3 总RNA的提取 分别收集各组细胞(正常对照组、TNF-α干预组、TNF-α+注射液组)，弃去上清，直接在培养板中加入1 ml TRIzol裂解细胞，反复吹打，直至无肉眼可见沉淀，转移至1.5 ml离心管中，室温静置5 min;加入0.2 ml氯仿，剧烈摇荡15 s，室温静置3 min;4℃ 10 000 r/min离心15 min，转移最上层到另一离心管中;加入500 ml异丙醇，混匀，室温静置20 min;4℃ 10 000 r/min离心10 min，去上清;弃去上清，加入

2结果

TNF-α导致ECV304细胞ET-1和ICAM-1基因表达增加，丹参川芎嗪注射液能够抑制TNF-α所导致的ET-1和ICAM-基因表达的增加，随着注射液浓度的增大，抑制程度逐渐加强。见表1。

表1 ECV304细胞中ET-1基因的表达(x ± s，%)

3讨论

血管内皮既是感知器官，同时又是效应器官。它作为中介，在感受血流压力变化、炎性信号及循环体系中的激素水平的同时，作出相应的反应，调节血管舒缩状态，从而维持平衡。血管内皮合成并释放血管舒张因子〔如一氧化氮(NO)〕和收缩因子(如ET-1)，通过自分泌、旁分泌、内分泌作用调节局部和全身血管的张力。血管内皮细胞的绝大多数功能与它能产生、释放、活化多种不同作用的生物活性物质相关〔3〕。

内皮细胞功能障碍是AS疾病的发病基础。当血管内皮细胞受到各种危险因素如高血压、高血脂和免疫损伤时，循环系统中的TNF和白细胞介素等细胞因子使得内皮细胞功能受到破坏，持续的刺激形成慢性内皮细胞活化状态，内皮细胞表达的生物活性物质数量或功能发生改变〔4〕。ICAM-1几乎参与了单核细胞黏附和迁移转化的全过程，当血管内皮细胞受到损伤时，刺激ICAM-1表达增加，促进和加速了AS发生和发展〔5〕。

中医称AS为“脉络痹”。血瘀证与血管内皮损伤有着密切联系，利用活血化瘀药可以调节血管内皮细胞的内环境及其分泌功能，从而调节内皮功能。活血化瘀中药具有抗血管内皮损伤、防治AS的作用〔1〕且取得良好的临床效果〔2〕。

丹参可以明显抑制AS板块的形成，可以调节血管内皮细胞生成而产生抗AS的作用〔6〕。丹参素是丹参的主要有效成分，具有改善微循环、促进纤维蛋白溶解、降低全血黏滞度、改善血液流变性及微循环障碍等作用〔7〕。川芎味辛性温，功能为活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛。川芎嗪是川芎的有效成分，化学结构为四甲基吡嗪，具有扩张微血管、改善微循环、降低血黏度、改善血液流变学、降低毛细血管通透性、延缓AS发生发展及抗炎等作用，在防治心脑血管疾病等方面的防治中具有重要的作用〔8～10〕。

本文结果可见，丹参川芎嗪注射液在临床上的抗动脉粥样硬化作用与其对内皮细胞功能的保护作用密不可分。

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5 Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis：a perspective for the1990s〔J〕.Nature，1993;362(6423)：801-9.

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7 杨继英.丹参素的药理作用研究进展〔J〕.中华临床医学杂志，2007;8(4)：45-6.

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10 吴红金，吕俊萍，马增春，等.川芎嗪对培养人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2005;11(3)：40-3.