头孢菌素类抗生素在乙腈/NaCl双相体系中的分配

周 栩，张 艳，赵凤生

(上海交通大学 药学院，上海 200240)

头孢菌素类抗生素在乙腈/NaCl双相体系中的分配

周 栩，张 艳，赵凤生

(上海交通大学 药学院，上海 200240)

目的 研究几种头孢菌素类抗生素在亲水有机溶剂、无机盐和水组成的双相体系(乙腈/NaCl体系)中的分配规律。方法 用滴定法制作体系的相图，HPLC测定头孢菌素在两相中的浓度。结果 头孢菌素浓度和温度对头孢菌素的分配影响不大;NaCl浓度和乙腈浓度则有一定影响，两者浓度的增加都使头孢菌素向下相(盐相)转移;pH对头孢菌素的分配有较大影响，pH很低时头孢菌素主要分配在上相(乙腈相)，pH升高到3.8左右大部分头孢菌素即转移到下相。结论 通过调节pH，用亲水有机溶剂/盐双相体系萃取分离头孢菌素类抗生素是可行的。

亲水有机溶剂/盐双相体系;分配;头孢菌素

在生化分离领域，双水相萃取技术已经引起了人们极大的重视。双水相萃取体系是2种化学结构不同的亲水性高聚物或者1种亲水性高聚物和1种无机盐在水中以适当的浓度形成互不相溶的两层液相，利用生物物质在两种水相间分配系数的差异可以进行萃取分离。双水相萃取分离技术由于条件温和、容易放大、可连续操作，被广泛用于生物化学、生物化工等领域的产品分离和提取。传统的双水相体系多为聚乙二醇/右旋糖酐或聚乙二醇/磷酸盐组成。由于水溶性高聚物难以挥发，黏度较大，不易操作，常给后续处理带来困难。右旋糖酐等水溶性高聚物价格昂贵，操作成本高。事实上，可与水以任何比例混溶的亲水有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈)在无机盐存在的条件下也可与水生成双相体系。用这种双相体系萃取分离化学物质和生物物质在国内外刚起步，但已显示出很多优点:溶剂丰富价廉，环境友好温和，所用试剂低毒或无毒、低残留、低黏度，传质和分相速度快，乳化现象少。已经用于萃取分离金属络合物或金属离子［1-2］、植物有效成分［3-6］、蛋白质和酶等生物大分子物质［7］。

本文考察了头孢噻肟钠、头孢呋辛钠、头孢唑啉钠、头孢哌酮钠(图1)等4种头孢菌素在乙腈/NaCl双相体系中的分配情况。

图1 4种头孢菌素类抗生素的结构式Fig.1 The structures of four kinds of cephalosporins

1 材料和仪器

头孢呋辛钠(上海新亚药业有限公司);头孢噻肟钠、头孢唑啉钠(哈药集团三精制药有限公司);头孢哌酮钠(中诺药业石家庄有限公司);乙腈、氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

AB204-N型电子分析天平(梅特勒-托利多(中国)集团);电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂);1100系列高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。

2 方法

2.1 测定乙腈/NaCl体系的相图

将乙腈5 mL装入锥形瓶，用NaCl溶液滴定。随着NaCl溶液的加入，溶液由澄清变为浑浊，记录加入NaCl溶液的体积。加入适量水，溶液变澄清，继续滴加NaCl溶液，溶液又变浑浊。如此重复，直到一次加入NaCl溶液25 mL后液体不变浑浊为止。滴定第一次时，由于乙腈浓度很高，为避免滴定过量，用0.1 g/mL NaCl溶液滴定，以后用 0.3 g/mLNaCl溶液滴定。根据每次滴定所加入的NaCl溶液体积，计算溶液中乙腈和NaCl的浓度，作出相图的右边一半(高浓度乙腈、低浓度NaCl的一半)。

相图的左边一半应该用乙腈滴定NaCl溶液。如果采用上述滴定后加水再次滴定的方法，滴定所需要的乙腈量会很大，所以采用分次滴定的方法:取若干个锥形瓶，各加入0.3 g/mL NaCl溶液4 mL，再加入不同体积的水，分别用乙腈滴定，直至溶液浑浊。计算溶液中乙腈和NaCl的浓度，作出相图的左边一半(低浓度乙腈、高浓度NaCl的一半)。

溶液的密度用比重瓶测定。根据密度将滴定体积换算为质量。

2.2 双相体系分配头孢菌素

在刻度试管中加入一定量的乙腈、NaCl溶液和头孢菌素溶液，加入水到10 mL，用酸或碱调节pH值，混合均匀后置于恒温水浴中。等分相达到稳定后，记录两相的体积，从上下相各取一定体积的样品，离心后用HPLC测定头孢菌素的浓度。

2.3 HPLC测定头孢菌素

柱温为35℃，检测波长为254 nm，色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)柱。流动相:0 ～18.5 min 为水-甲醇-0.01 mol/L NaH2PO4溶液(66∶16∶18);18.5 ～ 23.8 min 为水-甲醇-0.01 mol/L NaH2PO4溶液(50∶40∶10)。流速:1 mL/min。

2.4 分配系数、相比和收率的计算

头孢菌素的分配系数=(上相中某种头孢菌素类抗生素的浓度)/(下相中同种头孢菌素类抗生素的浓度)。

双水相体系的相比=(分相后上相体积)/(分相后下相体积)。

头孢菌素在某一相的收率(%)=某一相中的头孢菌素量/两相中的头孢菌素总量。

3 结果和讨论

3.1 乙腈/NaCl体系的相图

用滴定法测定的乙腈/NaCl体系的相图如图2。

图2 乙腈/NaCl体系相图Fig.2 Phase diagram of acetonitrile/NaCl system

相图的左半段表示下相的组成，含较多的水和NaCl，含乙腈较少;相图的右半段表示上相的组成，含乙腈较多，含NaCl较少。上相的亲水性虽小于下相，但高于疏水溶剂(正己烷、苯、氯仿等)，因为其中含有的水份远高于疏水溶剂中水的溶解度。

温度升高时相图略向上移，表明温度高时分相所需NaCl浓度和乙腈浓度稍微高一些。

3.2 头孢菌素类抗生素的浓度对分配的影响

在以下的实验中，除了特别指明外，双相体系分配头孢菌素的条件如下:双相体系中含每种头孢菌素各 5 mg、NaCl 0.8 g、乙腈 5.5 mL、水 4.5 mL，pH 5.7 ～5.9(自然 pH)，35℃。

用不同浓度的头孢菌素类抗生素加入双相体系中，考察其在双相中的分配和相比，结果见表1。

各种头孢菌素在0.4～1.0 mg/mL浓度范围内分配系数大体不变，这符合分配定律。头孢呋辛钠和头孢哌酮钠的分配系数较高，而头孢噻肟钠和头孢唑啉钠的分配系数较低，说明前两者的疏水性大于后两者。在头孢菌素浓度0.2～0.4 mg/mL范围，分配系数随浓度的增加而减少，说明头孢菌素浓度很低时不符合分配定律。在整个试验浓度范围内，各种头孢菌素的分配系数均小于1，因为这4种头孢菌素类抗生素均为极性化合物，所以主要聚集于下相(盐相)。

相比变化不大，说明头孢菌素浓度对相比没有太大影响。

3.3 温度对头孢菌素分配的影响

考察不同温度下头孢菌素在双相体系中的分配，结果见表2。

表1 头孢菌素浓度对分配和相比的影响Tab.1 Effect of cephalosporin concentration on partition and phase ratio

在乙腈/NaCl体系中，各种头孢菌素的分配系数随着温度的升高而逐渐上升，但上升幅度不大，原因可能是温度升高增加了头孢菌素在上相的溶解度。相比变化也不大，维持在0.8左右。这说明温度对乙腈/NaCl体系的影响较小。

3.4 NaCl浓度对头孢菌素分配的影响

固定双相体系的其它条件，加入不同量的NaCl，考察盐浓度对头孢菌素分配的影响。结果见图3。

实验中所选取的盐的最低浓度接近双相能分相的最低盐浓度，盐的最高浓度则接近双相能分相且盐刚析出时的浓度。从图3可以看到，随着盐浓度的升高，分配系数都呈下降的趋势。原因是随着盐浓度的升高，下相的极性逐渐增大，头孢菌素作为极性较高的物质，更多地聚集在下相。盐浓度增加时相比略有增加，原因可能是下相中高浓度的盐将乙腈排挤到上相，使相比增大。

3.5 乙腈浓度对头孢菌素分配的影响

表2 温度对分配和相比的影响Tab.2 Effect of temperature on partition and phase ratio

图3 NaCl浓度对分配和相比的影响Fig 3 Effect of NaCl concentration on partition and phase ratio

固定双相体系的其它条件，在水1.5 mL中加入NaCl 0.2 g和不同量的乙腈，考察乙腈浓度对头孢菌素分配的影响。结果见图4。

图4 乙腈浓度对分配和相比的影响Fig 4 Effect of acetonitrile concentration on partition and phase ratio

乙腈浓度的选择范围，是从分相所需的最低乙腈浓度，到可以分相而NaCl未析出所能达到的最高乙腈浓度。由图4可知，随着乙腈浓度的增加，相比较快上升，因为上相是有机相，乙腈浓度的提高使上相体积增长，因而相比有明显增加。由于上相有机溶剂浓度的增加，极性减弱，促使极性的头孢菌素向下相转移，因而分配系数逐渐降低。

3.6 pH值对头孢菌素分配的影响

各种pH值下头孢菌素在双相体系中的分配情况见表3。

从表3可知，溶液的pH是对乙腈/NaCl体系中头孢菌素的分配系数影响最大的因素。pH值由1.87上升到3.81时，4种头孢菌素的分配系数均由远大于1急剧减小到小于1，即大部分头孢菌素由上相转移到了下相。但pH从3.81变化到9.55时，分配系数变化不大，均小于1，头孢菌素主要分配于下相，这和头孢菌素为酸性物质有关。

溶液的pH值上升时，相比增加，表明此时盐对乙腈的排斥作用增大。

为比较不同pH值下头孢菌素在亲水有机溶剂/盐双相体系与疏水有机溶剂/水双相体系中的分配情况，用乙酸丁酯和水配制疏水有机溶剂/水双相体系，组成为:乙酸丁酯5 mL、水5 mL，含每种头孢菌素各5 mg，调节到不同pH，在35℃考察头孢菌素在其中的分配。由于在HPLC测定时，乙酸丁酯的出峰位置与头孢哌酮钠的出峰位置重合，干扰头孢哌酮钠的测定，所以去除头孢哌酮钠，只选其它3种头孢菌素进行实验。结果见表4。

在 pH 1.74～3.36范围内，乙酸丁酯/水双相体系中分配系数随pH的升高而急剧降低，即在此pH范围，pH增高使头孢菌素的极性增加，于是从上相(有机相)转移到下相(水相)。在pH 3.36以上，分配系数很低。相比变化不大，表明乙酸丁酯和水的互溶度不随pH而变化。

表3 pH对分配和相比的影响Tab.3 Effect of pH on partition and phase ratio

表4 pH对乙酸丁酯/水双相体系中头孢菌素的分配和相比的影响Tab.4 Effect of pH on partition and phase ratio of cephalosporins in n-butyl acetate/water two-phase system

将表3和表4比较，在乙腈/NaCl双相体系中，头孢菌素在低pH时的分配系数都远大于1，说明上相有一定的亲水性;而在乙酸丁酯/水双相体系中，几种头孢菌素的分配系数始终小于1，因为乙酸丁酯的疏水性强。因此，使用乙腈/NaCl体系，可以在酸性条件下将头孢菌素萃取到上相，而在中性或碱性条件下将头孢菌素反萃取到下相，实现头孢菌素的萃取分离。用乙酸丁酯/水体系，由于难以将大部分头孢菌素萃取到上相，不能用在头孢菌素提取中。目前生产上提取头孢菌素主要使用大孔树脂吸附和离子交换相结合的方法。本文提出的方法为头孢菌素的液-液萃取提出了一条新的途径。

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Partition of cephalosporins in acetonitrile/NaCl two-phase system

ZHOU Xu，ZHANG Yan，ZHAO Feng-sheng
(School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China)

Purpose To investigate the partition of several kinds of cephalosporins in two-phase system composed of hydrophilic organic solvent，inorganic salt and water，such as acetonitrile/NaCl system.Methods The phase diagram of acetonitrile/NaCl system was made by titration.Cephalosporin concentration was determined by HPLC.Results Cephalosporin concentration and temperature affected the partition of cephalosporins a little.NaCl concentration and acetonitrile concentration affected the partition at certain degree.When these concentrations increased，cephalosporins were moved from top phase(acetonitrile phase)to bottom phase(salt phase).The effect of pH on the partition was great.At low pH，cephalosporins were distributed mainly at top phase.When pH increased to 3.8，most of cephalosporins were transferred to bottom phase.Conclusion It is practicable to extract cephalosporins by adjusting pH of the two-phase system.

hydrophilic organic solvent/salt two-phase system;partition;cephalosporin

TQ028.3;TQ460.72

A

1005-1678(2012)02-0113-05

2010-09-23

周 栩，女，硕士研究生，研究方向为生物物质的分离纯化;赵凤生，通信作者，Tel:021-34204528，E-mail:fszhao@sjtu.edu.cn。