野油菜黄单胞菌中gum D基因的过表达对产黄原胶的影响

王桂兰，张晓元，陈晓燕，朱希强，凌沛学

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东省生物药物研究院博士后科研工作站，山东 济南 250101)

野油菜黄单胞菌中gum D基因的过表达对产黄原胶的影响

王桂兰1，2，张晓元2，陈晓燕2，朱希强1，2，凌沛学1，2

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东省生物药物研究院博士后科研工作站，山东 济南 250101)

目的 在野油菜黄单胞菌58(Xc58)中过量表达产胶基因gum D，提高黄原胶发酵产量和质量。方法通过PCR扩增、重组质粒构建、三亲本接合等方法，将重组质粒pBBR-gum D转入原始菌Xc58。结果 工程菌与原始菌相比，黄原胶产量提高11.19%，黏度提高6.31%，重均分子质量提高20.21%，乙酰基含量提高77.07%，丙酮酸含量下降6.34%。结论 改造后的菌株的黄原胶发酵产量和质量都较原始菌株有所提高。

黄原胶;gum D;重组菌株

黄原胶(xanthan gum)是由野油菜黄单胞菌或甘蓝黑腐病黄单胞菌，以糖类为主要原料，经有氧发酵产生的一种胞外多糖。它由五糖重复单元组成，此单元中D-葡萄糖、D-甘露糖和D-葡糖醛酸的摩尔比为2∶2∶1。甘露糖上不同程度地被乙酰化和丙酮酸修饰［1］。有研究表明，乙酰基对黄原胶分子构象有稳定效应，而丙酮酸利于分子间交联［2］。因黄原胶具有独特的增稠性、触变性和稳定性，已被广泛应用于食品、医药、化妆品、陶瓷、石油等多种行业［3］。近年来，黄原胶的生产水平和规模在不断提高，具有很大的商业前景［4］。

目前，国外黄原胶的研究热点主要针对黄原胶发酵反应动力学和代谢网络分析，从各个角度阐述黄原胶的高产机制，并在此基础上改进工艺，提高产品产量和质量［5］。产黄原胶基因陆续被分离、测序，其中gum基因簇被认为是直接影响黄原胶结构和组成的一类结构基因。Katzen等［6］通过基因敲除的方法对12个gum相关基因(B-M)的产胶功能进行了鉴定。通过过量表达部分gum相关基因，获得具有遗传稳定性的黄原胶基因工程菌株，可生产不同结构和组成的黄原胶。目前，尚未见利用基因工程改造黄原胶生产菌种用于工业化生产的报道。相关研究发现［7］，产胶基因gum D可表达葡糖转移酶，在黄原胶合成过程中，调控第一个葡萄糖残基与脂质中间体的连接，是黄原胶合成过程中的关键酶。本实验室通过过量稳定表达gum D基因，试图得到优于原始菌产胶能力的工程菌，提高黄原胶产量和质量。

1 材料

野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris 58)，大肠杆菌(E.coli Top10)及质粒pBBR-MCS-5均由本实验室保存;pRK2073质粒由美国华盛顿大学Ekaterina Latypova教授惠赠。

YM培养基和LB培养基分别用于Xc58种子及E.coli培养;10 L发酵培养基:淀粉6%，豆饼粉0.4%，碳酸钙 0.4%，硫酸镁 0.2%，氯化锰0.02%，谷氨酸钠0.1%。

限制性内切酶HindⅢ、Taq酶(TaKaRa公司);凝胶试剂盒(北京天根生物技术公司)。

DAWN EOS多角度激光散射仪(Wyatt technology corp，USA);DV-E 黏度计(Brookfield，USA)

2 方法

2.1 gum D基因的克隆及分析

根据GenBank公布的Xc58全基因核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0软件，设计引物 gum D1:5'CCCAAGCTTATGCTTTTGGCAGACTTGAG 3'，gum D2:5'CCCAAGCTTTCAGTACGCGGTCTTCTGTC 3'，引 物两端含有HindⅢ酶切位点，用于构建表达载体。

2.2 DNA 的操作

PCR扩增、质粒DNA的提取、纯化、酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA体外连接、转化、三亲本接合法等均按照文献［8-9］方法进行。

2.3 测序

对验证正确的阳性转化子抽提质粒进行基因测序，以判断构建的重组质粒中是否含有完整的gum D基因，由博尚生物技术有限公司完成测序并进行序列分析。

2.4 质粒稳定性实验

质粒稳定性实验参照Meacock介绍的方法［10］进行。将30℃振荡培养过夜的菌液，以10%量接种于含庆大霉素(Gm)30μg/mL的YM培养基100 mL中，培养12 h后，转接到无Gm的YM培养基中继续培养24 h，再转接培养两代后，将培养物稀释适当倍数，取稀释液100μL涂布于普通YM琼脂平板，48 h后，随机挑取单菌落100个，转种于含Gm的YM琼脂平板上，30℃培养48 h并进行菌落计数。

2.5 发酵液黏度测定

转入gum D的工程菌株Xc58-D与原始菌株Xc58于10 L发酵罐发酵培养72 h，发酵条件为:温度30℃，转速450 r/min，通气速率15 L/min，pH 7.0。发酵结束，用s05号转子30 r/min下测定发酵液黏度值。

2.6 发酵液产胶量测定

取发酵液适当稀释后，12 000 r/min离心10 min除去菌体及剩余淀粉，上清液用两倍体积乙醇沉淀黄原胶多糖，50℃真空干燥后称重，并换算成单位重量发酵液中的含胶量。

2.7 黄原胶的纯化

取发酵液适当稀释后，12 000 r/min离心10 min除去菌体，加入适量活性炭粉末，酸性条件下吸附1 h，硅藻土预涂布氏漏斗，抽滤取滤液，0.45μm滤膜过滤，将滤液用2倍无水乙醇沉淀，50℃真空干燥后称重。

2.8 黄原胶分子质量的测定

采用多角度激光散射仪测定黄原胶分子质量:流动相 0.2 mol/L NaCl溶液，流速 0.6 mL/min，柱温35 ℃，进样浓度0.05 mg/mL，进样量500 μL，黄原胶分子 dn/dc值为0.181［11］，得到的是重均分子质量(MW)。

2.9 乙酰基及丙酮酸含量测定

乙酰基和丙酮酸含量测定分别采用2，4-二硝基苯腙比色法［12］和异羟肟酸比色法［13］。

3 结果

3.1 PCR 扩增反应

以Xc58基因组DNA为模板，经引物gum D-1/2扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示大小约为1.5 kb的单一条带，见图1，与预期大小相符。

3.2 pBBR-gum D重组质粒的构建

PCR扩增产物经HindⅢ酶切纯化后连接于同样经HindⅢ酶切的pBBR-MCS-5质粒中获得重组质粒pBBR-gum D(图2)。CaCl2转化E.coli Top10感受态细胞，挑取多个独立的白色菌落扩大培养，提取质粒进行电泳验证，选择阳性重组质粒进行DNA序列测定，进一步验证扩增片段及连接方向的正确性。

图2 pBBR-gum D重组阳性质粒电泳图Fig.2 pBBR-gum D positive recombinant plasmid by electrophoresis

3.3 Xc58-D基因工程菌株的构建及质粒稳定性验证

将 Xc58、Top 10(pBBR-gum D)和 Top 10(pRK2073)以三亲本接合方法在Gm抗性琼脂平板上获得阳性转化子，提取质粒经测序鉴定序列正确。经质粒稳定性实验表明，该质粒可以在Xc58中稳定存在，经过三代72 h无抗性培养后，质粒稳定性100%，适合工业生产应用。

3.4 黄原胶发酵过程中黏度及产量变化曲线

Xc58、Xc58-D经10 L发酵罐发酵培养72 h，每隔8 h取样，分别测定发酵液黏度及产胶量，结果如图3～4。

Xc58菌种最后发酵液的黏度为6 810 mPa·s(s05，30r/min)，产胶量为28.07g/kg。Xc58-D菌种发酵液的黏度为7 240 mPa·s(s05，30 r/min)，比Xc58 提高了6.31%，产胶量为31.21 g/kg，比 Xc58提高了11.19%。

图3 Xc58和Xc58-D发酵液黏度曲线图Fig.3 Fermentation broth viscosity curve by Xc58 and Xc58-D

图4 Xc58和Xc58-D产胶量曲线图Fig.4 Production curve of xanthan gum by Xc58 and Xc58-D

3.5 Xc58-D与Xc58产黄原胶质量的比较

将上述发酵所得样品进行纯化，分别配成1%的溶液，再测黏度。另外，取适量两样品粉末，分别测定 MW、乙酰基及丙酮酸含量。结果见表 1。Xc58-D发酵的黄原胶经纯化后的黏度、MW、乙酰基含量比 Xc58分别提高了 5.26%，20.21% 和77.07%，丙酮酸含量则下降了6.34%。

表1 Xc58和Xc58-D发酵黄原胶质量比较Tab.1 Quality comparison of xanthan gum from Xc58 and Xc58-D

4 讨论

黄原胶的工业应用主要依赖其较高的黏弹性及优良的流变学性质。这些性质与黄原胶的分子质量、乙酰基和丙酮酸等的含量有密切关系，即分子质量的大小及有关基团的含量高低影响黄原胶的质量。我国目前黄原胶的生产能力与国外相比尚有差距，我们在努力提高黄原胶的工业化产量的同时，更应该注重质量的提高［14］。

运用基因工程的手段发现有利于提高黄原胶产量及质量的基因，并能实现稳定性遗传，是实现黄原胶工业化突破的重要手段。gum D编码黄原胶合成的关键酶，影响合成的起步阶段。本研究证明了过量表达gum D可得到黏度和Mw更高的黄原胶，同时乙酰基和丙酮酸含量也发生变化，为黄原胶品种多样性的继续研究提供借鉴。

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Effect of by overexpressing gum D in Xanthomonas campestris on the xanthan gum

WANG Gui-lan1，2，ZHANG Xiao-yuan2，CHEN Xiao-yan2，ZHU Xi-qiang1，2，LING Pei-xue1，2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Postdoctoral Scientific Research Workstation，Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

Purpose To improve the yield and quality of xanthan gum by overexpressing gum D in Xanthomonas campestris 58(Xc58).Methods By PCR amplification，plasmid construction，triparental conjugation and other methods，pBBR-gum D was transformed into the original strain Xc58.Results Compared with Xc58，the recombinant strain Xc58-D has increased by 11.19%in the yield of xanthan gum，by 6.31%increased in viscosity，by 20.21%increased in molecular weight，and by 77.07%increased in acetyl content，but 6.34%decreased in pyruvate content.Conclusion The recombinant strain has a higher yield and improves the quality of xanthan gum.

xanthan gum;gum D;recombinant strain

TQ460.38

A

1005-1678(2012)02-0106-04

2011-07-19

国家“十一五”科技支撑计划(编号:2008BAI63B08)

王桂兰，女，硕士研究生，微生物与生化药学专业;凌沛学，男，通信作者，研究员，博士生导师 Tel:0531-81213003，E-mail:lpx@sdfmg.com。