根用芥菜花药培养技术体系研究

王 萌,向极钎，汪李平,殷红清,马 进

(1.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000；2.华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 430070)

根用芥菜(Brassicajunceavar.megarrhizaTsen et Lee)又名大头菜，属我国特产蔬菜.我国大头菜育种相对比较落后，严重地制约着生产的发展.利用花药培养技术可以加速育种进程.花药培养技术发展迅速,特别是在十字花科作物上，已成为重要的育种手段，而在根用芥菜上，相关的研究很少[1-2].

本研究旨在探索根用芥菜花药培养过程中最适培养基、激素、预冷时间、热激时间等，建立其较为完善的花药培养胚状体诱导体系，从而获得DH系，加速育种进程.

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以著名地方品种-襄樊狮子头芥菜(大头菜)为材料.采取常规栽培管理，株现蕾后，摘取健壮无病虫的花蕾进行试验.丢弃有病、有虫、畸形、开裂、柱头外露的花蕾，去除过大和过小的花蕾，花序上仅保留2.0～3.0 mm长度的花蕾(小孢子处于单核靠边期见封二图版4).将处理好的花序用湿纱布包裹放入培养皿中，置于4℃冰箱.

1.2 试验方法

将处理好的花序先在自来水下冲洗30 min，在超净工作台上，依次使用 75%的酒精灭菌30 s，0.1%的升汞灭菌10 min，无菌水清洗3次.在无菌滤纸上用尖头镊子轻轻剥开花蕾，取出花药，接种于培养基上，盖上培养皿，用parafilm膜封口.剥取花药时要尽量少伤及花药，尽量不要带花丝.在隔水式恒温培养箱中进行热激处理一定的时间后，转入25℃条件下黑暗静置培养，4周后统计胚状体诱导率.培养基琼脂含量为0.8%，pH5.8，121℃高温湿热灭菌[3].

1.2.1 不同培养基对出胚率的影响 不同的培养基在花药培养试验中报道结果不一，而且花药培养成功的报道相对较多.而在大头菜游离小孢子培养上报道较少，花药培养尚未见报道.所以本实验选用在十字花科作物上使用较多的MS、B5和改良的Keller培养基[4-6].其中MS、B5的蔗糖浓度为6%，改良Keller蔗糖浓度为10%[7].

1.2.2 激素对出胚率的影响 将花药接种于添加1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的Keller-10培养基中，以不添加激素的Keller-10为对照[8]，4周后统计不同处理间胚状体诱导率的差异.

1.2.3 预冷天数对出胚率的影响 将挑选好的花序用湿纱布包好放入4℃的冰箱进行预冷处理，处理天数分别为0、1、3、5 d，达到预定时间后取出进行花药培养，以不进行预冷处理为对照.

1.2.4 热激天数对出胚率的影响 花药接种后放入32.5℃恒温箱中进行热激处理，热激处理处理时间分别为0、1、2 d，处理结束后转入25℃恒温箱中进行黑暗培养.

上述试验的每个处理中，平均每个培养皿接种4个花蕾，每个处理10皿，两次重复.

表1 不同培养基对花药胚胎发生的影响

表2 激素对花药胚胎发生的影响

表3 预冷天数对花药胚胎发生的影响

2 结果与分析

2.1 培养基对出胚率的影响

本试验中，MS-6和B5-6两种培养基上没有获得胚状体，由表1得出结论，Keller-10培养基更适合进行大头菜的花药培养.实验中我们观察到，当花药从花蕾中剥出时，花药呈黄绿色，接种后3 d左右，花药变为亮黄色，稍微膨大，多数花药有明显的弯曲现象；随后花药的颜色慢慢变为黄褐色至褐色.大约3周后，某些花药上会有白色的针状物刺破花药壁钻出，这些就是子叶胚的雏形，子叶胚自胚根伸出后发育较快，约一周的时间就可看到完整的子叶胚(见封二图版5).

2.2 激素对出胚率的影响

由表2可以得出在添加激素的培养基中无胚状体产生，Keller-10培养基不添加激素更适合进行大头菜花药培养.在实验中发现，添加激素的培养基中，带有花丝的花药多数都有膨大现象，另外，在花药上特别是花药与花丝的断口处，常常形成一团白色半透明的愈伤组织，在接种的初期，愈伤生长很快，到后期慢慢褐化死亡.

2.3 预冷天数对出胚率的影响

由表3可以得出4℃处理5 d与处理3 d在对胚状体的诱导上存在显著差异，处理5 d的诱导率最低，预冷0、1、3 d三种处理之间在出胚总数和出胚率上存在差异，但是这种差异没有达到显著水平，所以4℃低温处理花序0、1、3 d都有较好的出胚率，低温处理3 d时，出胚率最高.

2.4 热激天数对出胚率的影响

热激处理的目的在于从外界给予花药内的小孢子一种刺激，促使它的发育途径偏转，由配子体发育转到孢子体发育途径上.在不同的物种，不同的种、品种间最适的热激的时间都不太一致，但多数认为热激处理是有效的.由表4可以看出，在本试验中也得出相似的结论，32.5℃热激处理1、2 d与不进行热激处理之间在出胚诱导上存在显著差异，热激处理1 d和2 d之间没有显著差异，但热激处理2 d稍好.

表4 热激天数对花药胚胎发生的影响

3 结论与讨论

通过比较MS、B5和改良Keller三种培养基对出胚率的影响，得出改良Keller更适合根用芥菜花药培养.在试验中观察到MS-6和B5-6培养基上接种的花药与在Keller-10上培养的花药相比，没有明显的不同，这可能是花药内的小孢子没有脱分化或者脱分化后发育在某个阶段停止，没有刺破花药壁钻出.另外还观察到如果接种的花药带有花丝，则很多花药膨大很明显(见封二图6～7)，甚至在花药的某个部位剧烈膨涨，呈半透明状，这些花药最终褐化死亡，没有胚状体产生，所以在接种时尽量去掉花丝.改良Keller与其他两种培养基最明显的差别在于Keller配方中大量元素的含量低，有机成分含量很高，在试验中，三种培养基在蔗糖浓度上也有较大差别，出胚率的差异是由哪个因素造成还有待进一步研究.

通过比较不同预冷时间对花药培养过程中出胚率的影响，得出4℃处理花蕾3 d最好，这一结果与前人的研究结果比较一致.4℃处理3 d出胚率最高，但3 d内对出胚率的影响差异不大，所以低温处理更实际的用途在于暂时保存花蕾，低温处理时间超过5 d，花蕾萎蔫对出胚不利.

通过比较是否添加6-BA和NAA对出胚率的影响，得出激素的添加不利于花药的出胚，这可能与添加的激素种类、浓度不合适有关，也可能是由于激素的添加导致体细胞增殖，消耗了营养物质和花药本身的内源物质，抑制了小孢子的脱分化或发育进而影响了出胚.激素对出胚率的影响还有待进一步研究.

[1] 陈玉萍，田志宏，陈爱武,等.包心芥菜游离小孢子培养的初步研究[J].华中农业大学学报,1998，17(1)：97-99.

[2] 刘冬，郭平仲，刘凡,等.芥菜(Brassica juncea L.)小孢子胚发生和植株再生[J].首都师范大学学报：自然科学版,1997,18(1)：79-84.

[3] 王涛涛.芸薹属蔬菜小孢子培养及自交不亲和性的分子鉴定[D].武汉：华中农业大学,2006.

[4] 宋宝香，冯辉，杨春喜.基本培养基和蔗糖浓度在大白菜花药培养中对胚状体诱导的影响[J].中国农学通报,2006,21(11):45-46.

[5] 王超楠，冯辉，姜凤英,等.羽衣甘蓝花药培养胚状体诱导初报[J].中国蔬菜,2006(6):23-24.

[6] 许忠民，张恩慧，欧承刚,等.不同因素对甘蓝花药愈伤组织诱导的影响[J].西北农林科技大学学报：自然科学版, 2006,34(9):71-74.

[7] 梅时勇，杨保国，姚芳,等.萝卜花药培养试验[J].中国蔬菜,2002(1)：35-36.

[8] 袁惠燕，侯喜林.温度预处理对不结球白菜杂种F1花药培养[J].南京农业大学学报,2008,31(4):144-148.