叶绿酸铁与环糊精包合性质的初步研究

孙俊梅，曾建，任勇

(1.成都大学生物产业学院，四川 成都 610106；2.南京师范大学江苏省医药超分子材料及应用重点实验室，江苏 南京 210097)

叶绿酸合铁(简称叶绿酸铁或铁叶绿酸)是叶绿素的金属螯合物，结构与人体血红素相似；其可溶性钠盐是中药生血宁的主要有效成分，机体吸收后可促进血红蛋白再生和补充机体铁元素，是治疗缺铁性贫血的良好药物.叶绿酸铁钠溶液pH高，稀释后易水解而析出难溶的酸型叶绿酸铁沉淀，溶液中及固体制剂的光、热稳定性皆较差，影响产品质量.因此提高酸型叶绿酸铁溶解性和稳定性，对改进生血宁产品具有重要意义.环糊精(CD)是葡糖糖残基以α-1，4糖苷键连接而成的环状化合物.CD具有“外亲水内疏水”的特点，可形成包合物改善客体分子的溶解度、溶出速度、稳定性和生物利用度等性质.常用天然CD有α-CD、β-CD、γ-CD.

本文中依据药物结构特性研究了叶绿酸铁与α-、β-和γ-CD的包合作用，表明包合技术对叶绿酸铁的性质具有良好的改进作用，其研究目前尚少见报道.

1 实验部分

1.1仪器与试剂Explorer电子分析天平(Ohaus Corporation USA)，UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，叶绿酸铁(江苏省医药超分子材料及应用重点实验室提供)，β-环糊精(上海化学试剂公司，重结晶2次)，α-环糊精(广州Maxdragon公司)，γ-环糊精(广州Maxdragon公司)，pH 6.86磷酸缓冲盐(上海雷磁创益仪器仪表有限公司).

1.2包合常数的测定[1-3]取pH 6.86磷酸盐缓冲液(25 mmol/L)配制一定浓度的叶绿酸铁溶液A，取溶液A配制CD的浓溶液B.取A液2.5 mL进行紫外扫描，依次向体系中加入20 μL的B液，记录体系紫外吸光度的变化.以1/ΔA对1/[CD] 作图，通过回归直线的斜率和截距可求得CD与叶绿酸铁的表观一级包合常数Ka.其中ΔA为加入CD后体系紫外吸光值的变化，[CD]为体系中CD的浓度.

1.3包合物的制备[4]采用研磨法制备包合物.精密称取叶绿酸铁以5倍量乙醇溶解，取3倍摩尔比的CD加入适量pH 6.86 磷酸盐缓冲液和叶绿酸铁乙醇溶液，常温锡箔纸避光研磨，至粘稠的糊状后室温真空干燥得固体包合物.

1.4 溶解性质研究

图1 叶绿酸铁溶液标准曲线

1.4.1 检测波长选择 取含10%乙醇的pH 6.86磷酸盐缓冲液配制适当浓度叶绿酸铁溶液，200～500 nm区间扫描显示叶绿酸铁在398.5 nm 有强紫外吸收峰且该波长下CD无吸收，故选择该波长作为检测波长.

1.4.2 标准曲线制备 精密称取叶绿酸铁10 mg于200 mL容量瓶，加入20 mL无水乙醇超声使其溶解，取pH 6.86磷酸盐缓冲液稀释并定容得母液；分别量取母液并用相同缓冲液稀释成8.0 ～ 36.0 μg/mL 系列浓度测试液，测定并记录398.5 nm吸光度，以吸光度(A)对浓度(C)作图(图1)，线性回归得标准方程：A=0.019 9C-0.003 1 (r=0.999 9).

1.4.3 溶出度和溶解度 分别取叶绿酸铁原料及相应量β-CD包合物置于50 mL烧杯，加入20 mL pH 6.86磷酸盐缓冲液，震荡2 min观测溶解速度，滤取溶液测定吸光度；另取样品避光超声30 min后静置5 h，滤取滤液稀释后测定吸光度，由标准曲线得叶绿酸铁溶解度.

1.5样品溶液光稳定性的研究取pH 6.86磷酸缓冲盐配制浓度40 μg/mL的叶绿酸铁溶液或包合物溶液，测定各样品吸光度A0，然后分别装于3只具塞试管，分别置于恒温棕色干燥器，1 000 lx 和4 000 lx光照箱，设定时间点分别取样，测定叶绿酸铁的含量或残留率，通过曲线回归推算药物的半衰期.

1.6固体样品热稳定性取叶氯酸铁及CD 包合物固体少许，测定含量后(0 d)于40 ℃温度下放置10 d，分别在5 d 和10 d 检测样品中叶氯酸铁的含量.

2 结果及讨论

表1 叶绿酸铁与CD的Ka及回归方程(398.5 nm)

2.1Ka的测定CD与客体分子的包合是一个动态平衡过程，包合物形成后，客体分子的吸收光谱产生位移或吸光强度发生改变.根据吸光度随CD浓度的变化可求得Ka(表1)，Ka值越大越易形成稳定的包合物.

实验发现，叶绿酸铁的紫外吸光度随着CD浓度的增大而增大，说明二者之间发生包合作用.另从表1可知，叶绿酸铁与CD的Ka为7.9～2 869.8 L/mol，呈现β-CD>α-CD >γ-CD的规律，表明β-CD与叶绿酸铁包合效果最好.

图2 叶绿酸铁结构及分子尺寸

叶绿酸铁分子结构如图2所示，采用ChaChe WorkSystem Pro.(6.1.8) 分子模拟系统计算叶绿酸铁分子各基团间距及CD内腔大小见表2.

由表2可知，叶绿酸铁分子母核两端原子间距较大，不易进入CD疏水内腔，其支链a空间为0.352 1 nm小于CD内径，是形成包合的主要部位.β-CD的空腔内径与叶绿酸铁支链空间基本适合，易于发生相互作用而形成稳定的包合物；而α-CD由于环的内径较小，匹配作用稍差而弱于β-CD的包合；γ-CD较大的空腔，疏水作用减弱包合松散，其作用力不足以使叶绿酸铁与γ-CD以稳定的包合物形式存在.

表2 CD与叶绿酸铁的计算机分子模拟结果

由于β-CD包合叶绿酸铁具有最大的Ka，所以进一步制备β-CD-叶绿酸铁包合物，考察β-CD对叶绿酸铁溶解度和光、热稳定性的影响，探索β-CD包合叶绿酸铁的改进效果及技术可行性.

2.2溶解性能研究测定结果显示，叶绿酸铁固有溶解度为81.6 μg/mL，但震荡2 min几乎不溶解(<8.0 μg/mL)；β-CD包合物震荡即快速分散溶解、溶液颜色迅速加深，2 min溶出量35.1 μg/mL；包合物溶液平衡后溶解度114.9 μg/mL，为叶绿酸铁溶解度的140%，表明β-CD对改善叶绿酸铁溶解度尤其是溶出度具有明显效果.

2.3光稳定性的研究表3为试验条件下溶液中各样品降解半衰期(T1/2).由表可知，避光条件下，样品β-CD对叶绿酸铁的作用导致稳定性略有下降，T1/2稍短于原料药，然而随着光照强度的增大，各样品分解的T1/2均逐渐减小(稳定性降低)，但包合态叶绿酸铁的T1/2减小幅度显著弱于原料药，β-CD的稳定性增强效果明显.说明叶绿酸铁与β-CD形成的包合物有利于增强叶绿酸铁的光稳定性.

2.4热稳定性的研究40 ℃条件下，5 d后叶绿酸铁及包合物的药物相对含量分别从0 d的100%降至58.4%和73.9%，10 d后进一步降到36.6%和52.3%；叶绿酸铁包合物含量均明显高于叶绿酸铁原料.由此说明，CD包合使叶绿酸铁的热稳定性得到明显提高，有利于延长产品货架期.

表3 试验条件下样品光稳定性的半衰期 h

3 小结

本文中通过研究系列CD与叶绿酸铁的Ka，探索CD包合叶绿酸铁的可能性，选择Ka较大的β-CD制得稳定的包合物，通过样品溶解性和光热稳定性测定证明包合技术对改进叶绿酸铁药学性质具有可行性.该结果对深入研究开发新型叶绿酸铁补血制剂提供了重要的技术基础.

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