灵芝孢子粉对戊四氮活化海马神经细胞bcl-2表达的研究

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯154007)

灵芝孢子粉对戊四氮活化海马神经细胞bcl-2表达的研究

张金波,王淑秋,张 虎,张淑红,张玉萍,刘月霞

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯154007)

癫痫是一种短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病,由于脑内神经元群过度放电所致的阵发性脑功能障碍。癫痫发作后可造成神经元死亡,而细胞凋亡是癫痫发作后神经元死亡的主要方式。灵芝孢子粉除了能清除自由基,发挥免疫调节作用、对神经系统还具有镇静和保护的作用。本实验研究灵芝孢子粉对戊四氮活化大鼠海马神经细胞bcl-2表达变化的影响,进一步探讨灵芝孢子粉的作用机制和癫痫与海马神经细胞凋亡调控基因之间的关系。

癫痫;细胞凋亡;神经元

癫痫是一种短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病,由于脑内神经元群过度放电所致的阵发性脑功能障碍[1]。癫痫发作后可造成神经元死亡,而细胞凋亡是癫痫发作后神经元死亡的主要方式。细胞凋亡是多个基因调控的过程,包括促凋亡基因和抗凋亡基因。近年来研究表明,bcl-2基因家族在细胞凋亡的调控过程中发挥重要作用。灵芝孢子粉除了能清除自由基,发挥免疫调节作用、对神经系统还具有镇静和保护的作用[2]。本实验研究灵芝孢子粉对戊四氮活化大鼠海马神经细胞bcl-2表达变化的影响,进一步探讨灵芝孢子粉的作用机制和癫痫与海马神经细胞凋亡调控基因之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

戊四氮(PTZ)、琼脂糖,(美国Sigma公司);反转录试剂盒、PCR试剂盒(宝生物工程有限公司);Trizol,美国 Invitrogen公司;氯仿、异丙醇、溴乙锭(上海生工生物工程技术有限公司);Rnase抑制剂(美国AB I公司);Marker,宝生物工程(大连)有限公司;Taq DNA 聚合酶(宝生物工程有限公司);灵芝孢子粉(佳木斯市野生灵芝种植基地)等。

1.2 主要仪器与设备

高速低温离心机,美国Sigma公司;医用低温冰箱,日本三洋电器有限公司;PCR仪,美国Thermo公司;PCR电泳仪,北京六一仪器厂;WH-851旋涡混合器,上海手术器械厂;GIS凝胶图像处理系统,上海天能科技有限公司。

1.3 实验动物及分组

由佳木斯大学实验动物中心提供雄性、健康3～5月龄、体重(200±20)g的Wistar大鼠30只。随机分成3组,分别是正常对照组、癫痫模型组和灵芝孢子粉用药组,每组10只。

1.4 实验方法

1.4.1 癫痫模型制备

正常对照组用生理盐水腹腔注射+生理盐水灌胃;癫痫模型组用PTZ腹腔注射+生理盐水灌胃;灵芝孢子粉组用PTZ腹腔注射+灵芝孢子粉灌胃。戊四氮用前以双蒸水新鲜配制成溶液(10g/L),灵芝孢子粉用前以双蒸水配制成溶液(浓度为30g/L)。致癫痫方法:每日上午11点,灌胃前禁食6h。腹腔注射剂量为35mg/kg,灌胃剂量为150mg/kg,每日1次,持续28d。停药1周,再用相同剂量的PTZ测试,凡获连续5次Ⅱ级或Ⅱ级以上惊厥发作的大鼠为完全点燃的大鼠癫痫模型。

大鼠点燃标准及惊厥发作评分标准[3]:

0级,无反应或抽搐停止,没有行为上的发作;Ⅰ级,湿狗样颤动,节律性嘴或面部抽动;Ⅱ级,面部阵挛、咀嚼或节律性点头甩尾;Ⅲ级,头部颤搐加前肢阵挛性抽搐;Ⅳ级,前肢阵挛、上身直立(袋鼠姿势)、多肢抽动或强直;Ⅴ级,失平衡、跌倒、四肢抽动;Ⅵ级,全面性强直-阵挛发作。

1.4.2 RT-PCR 检测bcl-2的表达

将各组大鼠断头取脑,迅速分离海马,使用Trizol提取海马组织总RNA,测定其浓度及纯度。严格按照反转录试剂盒推荐步骤操作,将总RNA 反转录为cDNA。引物序列:bcl-2上游:5’-CTGAACCGGCA TCTGCACAC-3’,下游:5’-GCA GGTCTGCTGACCTCACT-3’,扩增长度195bp;βactin 上游:5’-GAACCCTAA GGCCAACCGTG-3’,下游:5’-TGGCA TA GA GGTCTTTACGG-3’, 扩 增 长 度 为557bp。引物由上海生工生物工程技术公司合成。bcl-2PCR反应条件为:94℃2min,94℃45s,56℃45s,72℃45s,32个循环,72℃延伸5min。取PCR产物5μL行琼脂糖凝胶电泳,结果进行灰度值分析。

1.5 统计学处理

2 结果

本研究使用RT-PCR方法比较bcl-2在正常对照组、癫痫模型组和灵芝孢子粉用药组的mRNA 的表达(图1)。癫痫模型组和灵芝孢子粉用药组bcl-2的表达较正常对照组(0.64±0.05)均降低;其中癫痫模型组(0.54±0.12)bcl-2的表达水平与对照组(0.72±0.12)比较明显降低(P＜ 0.01),灵芝孢子粉用药组(0.66±0.14)bcl-2的表达水平与癫痫模型组比较明显升高 (P＜0.05),差异有统计学意义(图2)。

3 讨论

近年研究表明,癫痫发作可激发程序性细胞死亡机制即细胞凋亡,并参与脑损伤过程。凋亡一些研究发现,癫痫发作会发生细胞凋亡,如Pollard等[4]以海人酸(kainic acid,KA)诱导鼠癫痫持续状态(status epilepticus,SE),当向鼠杏仁核区注射KA后,可以观察到杏仁核区神经元细胞凋亡现象。喻良等用全蝎醇提物致大鼠SE后发现诱发SE后6h,大鼠海马CA 1、CA 3区出现TUN EL阳性细胞,并逐渐增多[5]。细胞凋亡是涉及多基因调控的复杂的主动死亡过程,其中bcl-2基因家族在细胞凋亡的调控过程中具有重要作用。bcl-2、bax基因是bcl-2基因家族的成员,其表达的蛋白产物bcl-2蛋白抑制细胞的凋亡,而bax蛋白则促进凋亡。而bcl-2蛋白可以与bax蛋白结合形成异二聚体,阻止其转位,bcl-2蛋白还可以控制Ca2+从内质网释放,抑制钙超载,还可以阻止自由基产生,抑制细胞膜上脂质过氧化物的形成,从而起到抗凋亡的作用。bcl-2水平的增高可抑制细胞凋亡,但这种自我保护机制是有限的,bcl-2可通过阻止细胞凋亡的早期环节而发挥作用,可阻止或降低细胞皱缩,染色质浓缩和DNA 裂解的发生等[6,7]。本研究结果证实,在PTZ点燃癫痫后,模型组和治疗组凋亡抑制基因bcl-2表达较正常对照组显著下降,表明bcl-2基因在细胞凋亡的调控过程中起到抑制作用,而给予灵芝孢子粉治疗后,bcl-2的表达与模型组比较显著增加,提示灵芝孢子粉有效成份能充分作用于脑组织,可以调控bcl-2的表达,借以发挥抗凋亡的神经保护作用。

[1]吕艳婷,王淑秋,宋立德.灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠大脑皮质及海马区PCNA变化的影响[J].黑龙江医药科学,2010,1(33):37-37

[2]王欢,王淑秋.灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠脑组织BDN F表达的影响[J].黑龙江医药科学,2006,29(2):5-7

[3]Martina EV,Uta R,PeterM,et al.Pentylenetetrazole(PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampusof kindled rats in suppressed by concom itant treatment w ith Naloxone[J].Brain Res,1998,792(3):299-308

[4]Pollard H,Charriant MC,Cantagrel S,et al.1Kainate-induced apoptoic celldeath in hippocampalneurons[J].Neuroscience,1994,63:7-9

[5]喻良,孙红斌,梁益,等.全蝎醇提物对Li2Pilo癫痫持续状态大鼠海马神经细胞凋亡的影响[J].中风与神经疾病杂志,2009,26(5):519-522

[6]Kitahara Y,Taga K,Abe H,et al.The effectsof anestheticson cortical spreading depression elicitation and C-fos expression in rats[J].J Neurosurg Anesthesiol,2001,13(1):26

[7]夏永勤,徐如祥,王向宇.亚低温对重型颅脑损伤后脑循环动力学的影响[J].中华创伤杂志,2000,16(10):603

Research of ganoderma lucidum spores on pentylenetetrazol activation Bcl-2 expression of hippocampal neurons

ZHANG Jin-bo,WANG Shu-qiu,ZHANG Hu,ZHANG Shu-hong,ZHANG Yu-ping,LIU Yue-xia
(Basis Medical Science College,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Epilepsy is a chronic brain disease characterized by short-term central nervous system disorders due to excessive discharge of brain neurons.Epileptic seizure can cause neuronal death,and cell apoptosis is the main way of neuron death after seizure.One BCL-2 gene fam ilies plays an important role in the regulation of cellapoptosis process.Ganoderma lucidum spores can not only eliminate the free radicals and regulate immune system,but also calm and protect nervous system.The exper iment studies the effect of ganoderma lucidum spores on the expression change of BCL-2 in the hippocampus nerve cells of rats of epilepsy,so as to further explore the relationship between the mechanism of ganoderma lucidum spores(GLS)and controlling gene of apoptosis in the hippocampus nerve cells of Epilepsy.

epilepsy;apoptosis;neuron

R742.1;R285

B

1008-0104(2012)04-0034-01

2012-03-06)

黑龙江省教育厅科研项目,编号:11553110。

张金波(1974～)女,黑龙江绥滨人,硕士研究生,副教授,研究方向:细胞凋亡。

王淑秋(1957～)女,黑龙江佳木斯人,硕士研究生导师,教授,研究方向:神经免疫内分泌。E-mail:wang_shuq@163.com。