尼莫地平对早期脑出血大鼠AQP4mRNA、MMP-9mRNA表达的影响

王复新,张 洁,王 辰,张军武,侯丽淳,杨 慧

(1.佳木斯大学附属第一医院神经内科,黑龙江佳木斯154003;2.佳木斯市中心医院神经内科,黑龙江佳木斯154002)

尼莫地平对早期脑出血大鼠AQP4mRNA、MMP-9mRNA表达的影响

王复新1,张 洁2,王 辰1,张军武1,侯丽淳1,杨 慧1

(1.佳木斯大学附属第一医院神经内科,黑龙江佳木斯154003;2.佳木斯市中心医院神经内科,黑龙江佳木斯154002)

目的:探讨尼莫地平对早期脑出血周边组织AQ P4mRNA、MMP-9mRNA表达及由脑出血引起的继发性脑水肿与AQ P4、MMP-9的关系。方法:制做脑出血大鼠模型,分为假手术组,脑出血组及尼莫地平组,分别观察6h、1d、3d、5d、7d等5个时间点出血周边脑组织含水量、AQ P4mRNA、MMP-9mRNA。结果:(1)脑出血组3d含水量达到高峰,第7天明显下降,但仍高于正常水平;尼莫地平组3d含水量达高峰,但低于脑出血组。(2)脑出血组AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的表达逐渐升高,3d达到高峰,7d明显下降,5个时间点明显高于假手术组。(3)尼莫地平组大鼠脑水肿程度、AQ P4mRNA、MMP-9mRNA表达逐渐升高,3d达到高峰,明显低于脑出血组。(4)脑出血的水肿程度与AQ P4mRNA、MMP-9mRNA呈正相关。结论:(1)AQ P4、MMP-9参与了出血性脑水肿损伤的过程。(2)尼莫地平可以抑制AQ P4、MMP-9的表达,进而减轻脑水肿的程度。

尼莫地平;早期脑出血;基质金属蛋白酶9

脑出血是神经内科的常见病之一,而血肿周围组织的脑水肿可以导致颅内压增高,重者形成脑疝,致死率高。故临床早期控制脑水肿的进展有利于患者的预后。目前脑水肿的发生及发展的病理生理学机制并不完全清楚,有多种因素共同参与,其中许多分子机制参与血肿周围组织水肿的形成及进展。本实验研究以脑出血大鼠为模型,在大鼠脑出血后用PCR法记录脑组织水通道蛋白4(aquaporin-4,AQ P4)mRNA、基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)mRNA的表达,探讨它们与脑水肿的关系,通过用尼莫地平干预脑出血大鼠,观察AQ P4mRNA、MMP-9mRNA及脑水肿的变化,为临床早期控制脑水肿提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 脑出血模型的制作和分组

选取雄性健康的Wistar大鼠150只,体重为200～240g,SPF级。大鼠均在实验前1w适应实验室环境,术前禁食水12h。假手术组50只,只进针不注血。参考Rosenberg[1]等方法复制大鼠脑出血动物模型100只,随机分为脑出血组50只,尼莫地平处理组50只。这三组再随机分为5个亚组,为6h、1d、3d、5d、7d等5个时间点,各10只。尼莫地平组腹腔注射尼莫地平,剂量为每公斤1mg,频次为Q 8h。

1.2 脑组织含水量测定

实验动物麻醉后断头取脑,以脑出血点为中心,取其后2mm 脑组织,约140～160mg,先用电子天平称湿重后,后置于96～100℃的烘箱中24h以上,量取干重,根据公式:脑组织含水量=(湿重一干重)/湿重×l00%,计算脑组织含水量百分比,表示脑水肿的程度。

1.3 血肿周边组织AQ P4mRNA、MMP-9mRNA 的检测

本实验采用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)进行,mRNA提取试剂采用Trizol试剂盒,采用宝生物工程公司生产的逆转录聚合酶链反应试剂盒。AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的结果利用凝胶图像分析,行电泳条带光密度与β-actin产物的光密度的比值作为本实验AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的指标。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 脑出血周边组织含水量的动态变化

脑出血组3d含水量达高峰后逐渐下降,第7天下降明显,但仍高于假手术组 (P＜ 0.05)。尼莫地平组给药后3d含水量达高峰,各时间点的含水量均低于脑出血组 (P＜ 0.05)。见表1。

表1 实验大鼠脑出血周边组织含水量(±s,%,n=10)

表1 实验大鼠脑出血周边组织含水量(±s,%,n=10)

与假手术组比较＊P＜ 0.05;与脑出血组比较#P＜ 0.05。

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表2 实验大鼠脑出血周边组织A PQ 4mRNA(±s,%,n=10)

表2 实验大鼠脑出血周边组织A PQ 4mRNA(±s,%,n=10)

与假手术组比较＊P＜ 0.05;与脑出血组比较#P＜ 0.05。

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表3 实验大鼠脑出血周边组织MMP-9mRNA(±s,%,n=10)

表3 实验大鼠脑出血周边组织MMP-9mRNA(±s,%,n=10)

与假手术组比较＊P＜ 0.05;与脑出血组比较#P＜ 0.05。

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2.2 脑出血周边组织A PQ 4mRNA的动态变化

出血组6hAQ P4mRNA较假手术组表达增加,随着出血时间延长,AQ P4表达逐渐增强,3d达高峰,7d逐渐下降(P＜0.05),尼莫地平组各时间点AQ P4mRNA较出血组降低 (P＜ 0.05)。见表2。

2.3 脑出血周边组织MMP-9mRNA的动态变化

脑出血组6h较假手术组即明显表达MMP-9mRNA,3d达高峰,各时间点的表达量与假手术组比较均有显著差异(P＜0.05),尼莫地平组给药后各时间点AQ P4表达明显降低 (P＜ 0.05)。见表3。

2.4 相关分析

脑出血组大鼠AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的表达与脑含水量的变化规律趋于一致(r= 0.714;0.726,P＜ 0.01)。

3 讨论

水通道蛋白是一种位于细胞膜上的内在膜蛋白,目前发现有13种水通道蛋白,其中AQ P4主要位于中枢神经系统。AQ P4主要功能为调节水盐代谢,进而影响到细胞内外的渗透压[2]。近年来,在脑组织水肿中AQ P4所发挥的作用已受到有关专家和学者的注意。文献也报道[3],脑组织中AQ P4的表达与脑水肿程度呈正相关。在脑水肿的形成和进展的过程中,AQ P4发挥着重要作用。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一个大的蛋白家族,需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子可以降解多种细胞外基质成分。MMP-9是被糖化的Ⅳ型胶原酶,可以降解Ⅳ型胶原,引起毛细血管的损伤,抑制营养物质的通路,导致基底膜破裂,血脑屏障被破坏[4]。MMP-9在脑组织缺血、缺氧和应激情况下释放增加。在基因转录的水平上,血小板源生长因子、白细胞介素1等生长因子可以诱导MMP-9增加;Nordqvist研究表明MMP-9与脑卒中后血管源性脑水肿的关系密切[5]。出血性脑水肿的机制可能血浆蛋白以及凝血酶释放的物质等积聚使细胞内外渗透压改变[6],激活位于血脑屏障基膜上的AQ P4,致使K+外流增多,Na+内流增加,导致细胞膜去极化、钙离子通道开放,大量Ca2+进入细胞,又会促进AQ P4的过度表达,使血脑屏障通透性增加导致脑水肿[7]。MMP-9降解细胞外基质会导致血脑屏障的破坏、炎症反应的扩散和巨噬细胞对内皮细胞的黏附等病理过程,加重脑水肿的发生。本实验中脑出血组6 h AQ P4mRNA、MMP-9mRNA明显高于正常水平,3d达到峰值,7d仍比正常组高,脑出血后AQ P4、MMP-9的过度表达与脑水肿的发展有密切关系。尼莫地平是二氢吡啶类钙拮抗剂,作用于二氢吡啶类电压依赖性钙通道受体,致使钙通道受体构型发生变化,从而阻断Ca2+内流,降低细胞内Ca2+浓度,提示尼莫地平有可能是通过阻断Ca2+内流,来降低AQ P4、MMP-9的表达。本实验中尼莫地平组较脑出血组脑含水量明显减少,AQ P4、MMP-9的表达明显低于脑出血组。可能与尼莫地平通过抑制炎症细胞分泌炎症因子,进而间接地控制了MMP-9的表达。AQ P4、MMP-9与Ca2+关系的具体分子机制目前还不明确,有待于进一步的实验研究。本研究结果表明MMP-9、AQ P4参与了出血性脑水肿的病理过程,尼莫地平可以抑制AQ P4、MMP-9的表达,进而减轻脑水肿的程度,为早期临床治疗出血性脑水肿提供了新的靶点。

[1]Longa EZ,W einstein PR,Carlson S,et al.Reversiblem iddle cerebralartery occlusion w ithoutcraniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-91

[2]MacAulay N,Hamann S,Zeuthen T.Water transport in the brain:role ofcotransporters[J].Neuroscience,2004,129(4):1031-1044

[3]Ke C,PoonW S,NgHK,et al.Heterogeneous responsesof aquaporin-4 in oedema formation in a replicated severe traumatic brain injury modelin rats[J].NeurosciLett,2001,301(1):21-24

[4]Fuj lmura M,Gasche Y,Morita-Fuj imura Y,et a1.Early appearance of activatedmatrix metalloproteinase-9 and blood brain barrier disruption in m ice after focal cerebral ischem ia and reperfusion[J].Brain Res,1999,842:92-100

[5]Nordqvist AC,Smurawa H,Mathiesen T.Expression of matrixmetalloproteinases 2 and 9 in meningiomas associated w ith different degrees of brain invasiveness and edema[J].J Neurosurg,2001,95(5):839-844

[6]XiG,KeepRF,HoffJT.Mechanism s ofbrain injury after intracerebralhaemorrhage[J].Lancet Neurol,2006,5:53-63

[7]Q ingW G,Dong YQ,Ping DQ,et al.Brain edema after intracerebralhemorrhage in rats:the role of iron overload and aquaporin4[J].Neurosurg,2009,110(3):462-468基金项目:黑龙江省自然科学基金项目,编号:D2007-37。

Effects of nimodipine on the expression of AQP4 andMMP-9 in early cerebral hemorrhage rats

WANG Fu-xin1,ZHANG Jie2,WANG Chen1,ZHANG Jun-wu1,HOU Li-chun1,YANG Hui1
(1.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China;2.Department of Neurology,JiamusiCentralHospital,Jiamusi 154002,China)

Objective:To discuss the expression of nimodipine on AQ P4 andMMP-9mRNA in early cerebral hemorrhage surrounding tissue and the relationship of secondary brain edema caused by cerebral hemorrhage and AQ P4、MMP-9.Methods:Cerebral hemorrhagemodelof ratswere divided into control group,cerebral hemorrhage group and n imodipine group.The water content of brain,AQP and MMP-9 mRNA were observed on 6h,1d,3d,5d,7d after intracerebral hemorrhage.Results:(1)On 3din the ICH group,the brain water content peaked and on 7dit decreased but still higher than normal.On 3din the nimodipine group,the brain water content peaked but still lower than ICH group.(2)AQ P4 and MMP-9 of cerebral hemorrhage group was higher than that of control group at five points,whose expression gradually increased,peaked on 3d,obviously decreased on 7d.(3)Rat’sBrain edema degree and expression of AQ P4 andMMP-9 in nimodipine group were less than those in cerebral hemorrhage group,whose expression gradually increased,peaked on 3d.(4)The degree of intracerebral hemorrhage edema and AQ P4 andMMP-9mRNA were positively correlated.Conclusion:(1)MMP-9 and AQ P4 involved in the process of hemorrhagic brain edema damage.(2)Nimodipine can inhibit the expression of AQ P4 andMMP-9 so as to reduce the degree of brain edema.

n imodipine;cerebral hemorrhage rats;matrixmetalloproteinase-9

R743.34

B

1008-0104(2012)04-0001-02

2012-04-15)

王复新(1956～)男,黑龙江佳木斯人,教授,硕士,硕士研究生导师,从事脑血管病发病机理与临床的研究。