十种热带雨林植物光活化抗微生物活性的筛选

胡 昀,陈 玉

(1中南民族大学 药学院，武汉 430074；2 中南民族大学 化学与材料科学学院，武汉 430074)

光敏剂在可见光或紫外光照射下将分子氧变成活性氧从而产生抗微生物活性[1]。光动力抗微生物化学疗法(PACT)就是利用光敏剂的光化学活性产生的活性氧杀死致病菌，光敏剂对致病菌的损伤比对机体细胞或组织大的多，因此抗微生物化学疗法备受关注[2]。从植物中寻找具有光调节生物活性的物质是发现新型光敏剂的重要途径之一，这些化合物在医药和绿色农药的研究中具有重要的理论价值和广阔的应用前景，受到当今医药和农药界的重视.从天然样品中发现新型结构的活性天然产物是天然产物化学研究的首要任务，据不完全统计，至今已从天然资源中发现了约15万种结构不同的天然化合物，尤其是来源于过去研究较少的热带雨林植物[3]，它是发现新型结构活性天然产物的重要宝库之一.

本文通过系统溶剂法分别提取了10种热带雨林植物(见表1)，通过滤纸扩散法筛选这10种植物的光活化抗微生物活性，并用薄层色谱生物自显影技术确定了活性化合物的部位.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

植物材料由云南西双版纳民族医药研究所提供和鉴定，其植物名称、编号和所属科名见表1[4,5].

表1 十种植物材料的拉丁文名

1.1.2 供试菌种

金黄色葡菌球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、草分枝杆菌(Mycobacteiumphlei)、环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)由中南民族大学生科院微生物教研室提供.

1.1.3 药品与试剂

薄层层析硅胶(GF254)-铝薄板(武汉药科新技术开发有限公司)，琼脂(天津市天达净化材料精细化工厂)，苯酚红(天津市科密欧化学试剂开发中心)，M-H培养基(Mueller-Hinton Broth，杭州微生物试剂厂，含酸水解酪蛋白、牛肉浸出粉、淀粉)，M-H琼脂培养基(Mueller-Hinton Agar，含Muller-Hinton Broth粉末、0.7%琼脂、0.002%苯酚红、硫酸卡那霉素，武汉华顺生物技术有限公司)，8-甲氧基补骨脂素(ACROS ORGANICS公司).

1.2 植物材料的提取

各种植物材料称取50g 并粉碎，用甲醇提取后，溶于甲醇和水 (1︰9) 的混合溶剂中，用石油醚萃取，得石油醚提取物.甲醇和水层脱溶后，加水溶解，依次用乙酸乙酯，正丁醇萃取，这样就获得了石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4个提取物.

称取3种芸香科植物竹叶椒茎木(ZanthoxylumarmatumDC.)，野花椒(ZanthoxylumutileHuang)，狗花椒(Zanthoxylumplanispinumsieb.et Zucc.) 各50g，粉碎后，用甲醇提取，得甲醇提取物.再用2 %的HCl溶解和乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯层脱溶后用甲醇和水 (体积比1︰9) 溶解，接着用石油醚萃取，分别得到非生物碱部分的石油醚和乙酸乙酯提取物.酸水层用10 %NaOH调pH值至9，依次用氯仿和正丁醇萃取，得脂溶性和水溶性生物碱.

1.3 生物活性测定

1.3.1 滤纸扩散法

[6]，将各提取物的浓度分别配成10 mg/mL的样品溶液，选用直径为6 mm的灭菌滤纸片，每张滤纸片中加10 μL样品，待溶剂挥发后，将已点样的滤纸圆片贴于已涂布各菌悬液200 μL(菌液浓度106～107cfu/mL)的M-H琼脂培养基，放置20min后，其中一组在紫外光(320～400nm)照射1 h后，置于37℃培养箱中培养过夜，第二天测抑菌圈大小，比较其在黑暗中和紫外光照射后抗微生物活性的大小.

1.3.2 薄层色谱自显影技术

参考文献[7] ，将提取物分别配成100mg/mL的样品溶液，依次取5,2.5,1.0,0.5μL点样于层析硅胶铝薄板上，然后放入层析缸，在一定极性的展开剂展开，待溶剂挥发后备用.

制备含苯酚红(0.002%)的M-H固体培养基20mL，灭菌冷却到40℃左右后加入200 μL的新鲜菌液(菌液浓度106～107cfu/mL)，摇荡均匀无菌操作倒入已放上述层析硅胶薄板的培养皿，并覆盖铝薄板，放置20min，待其冷却凝固后，其中一组在紫外光(320～400nm)照射1 h后，放入培养箱中37℃培养，过夜，第二天喷5mg/mL MTT水溶液观察结果(见图1).

2 结果与分析

10种热带雨林树木提取物光活化抗微生物活性结果见表2.由表2可见，对于枯草芽孢杆菌，在紫外光(UV)照射后和黑暗(dark)中其抑菌圈直径相差1mm有4个：布渣叶茎木正丁醇提取物(Y01-B)、白花丹根正丁醇提取物(Y04-B)、三丫苦根正丁醇提取物(Y06-B)和竹叶椒茎木石油醚提取物(Y09-P).抑菌圈直径相差2～3mm有3个：灯台树去皮茎木的乙酸乙酯提取物(Y05-E)、狗花椒的石油醚和乙酸乙酯提取物(Y10-P,Y10-E).对于金黄色葡萄球菌，在紫外光照射后和黑暗中其抑菌圈的直径相差1mm的提取物有9个：布渣叶茎木乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物(Y01-E,Y01-B)，五叶山小桔梗乙酸乙酯提取物(Y02-E)，灯台树去皮茎木乙酸乙酯提取物(Y05-E)，三丫苦根石油醚和乙酸乙酯提取物(Y06-P,Y06-E)，野花椒乙酸乙酯提取物(Y08-E)，竹叶椒茎木正丁醇提取物(Y09-B)和狗花椒的石油醚提取物(Y10-P).抑菌圈的直径相差2～3mm有1个：白花丹根正丁醇的提取物(Y04-B).10种植物材料中至少有8种有光活化抗1种微生物的活性，其中布渣叶茎木(Y01)，白花丹根(Y04)，灯台树去皮茎木(Y05)和狗花椒(Y10) 4种植物提取物对所测试的2种微生物有光活化抗微生物的活性.综上所述，从光活化抗微生物活性的强弱和范围来分析，狗花椒(Y10)可能含有潜在的新型光敏剂，是值的进一步研究的植物材料.

表2 九种热带雨林树木提取物光活化抗微生物活性

为进一步证明狗花椒(Y10)含有潜在的新型光敏剂，对3种芸香科花椒属的植物野花椒(Y08)、竹叶椒茎木(Y09)、狗花椒(Y10)按生物碱的方法提取，确定光活化抗微生物的活性部位，结果见表3.

表3 3种芸香科植物光活化抗微生物活性

比较3种芸香科植物光活化抗微生物活性，狗花椒(Y10)的活性最强，其活性部位为脂溶性生物碱，并通过狗花椒生物碱部分氯仿提取物(Y10-CA)薄层色谱自显影技术证实了上述结果，结果见图1.比较图1b和图1c，图1b没有抑菌现象，在图1c中Rf值约为0.3，有明显的抑菌现象，并随提取物量的减少抑菌圈变小.说明Y10-CA具有光敏活性，可待进一步分离纯化.

3 结语

通过对种热带雨林植物的光敏抗微生物活性筛选，发现狗花椒(Y10)活性最强.对3种芸香科花椒属的植物竹叶椒茎木(Y09)，野花椒(Y08)和狗花椒(Y10) 进行薄层色谱自显影，结果表明狗花椒生物碱部分氯仿提取物(Y10-CA)有明显的光活化抗微生物活性，并随提取物量的减少抑菌圈变小.为进一步从该植物中快速分离活性化合物奠定了实验基础.

a) Y10-CA(展开剂为V(环己烷)∶V(丙酮) = 7∶3，显色剂为Dragendorff试剂)；b) Y10-CA在黑暗中抗枯草芽孢杆菌肝菌；c) Y10-CA在紫外光照射后抗枯草芽孢杆菌肝菌

参考文献

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[2]Cassidy C M,Donnelly R F,Elborn J S,et al.Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) in combination with antibiotics for treatment of Burkholderia cepacia complex infection[J].Photochemistry and Photobiology B,2012,106: 95-100.

[3]庾石山,冯孝章.新型结构活性天然产物的化学研究[J].中国医学科学院学报,2004,26(4): 347-350.

[4]林燕芳,依 专,赵应红.中国傣医药彩色图谱[M].昆明: 云南民族出版社,2003: 16-17,41-42,203-204,271-272,303-304,523-524,559-560,648-649.

[5]陈冀胜,郑 硕.中国有毒植物[M].北京: 科学出版社,1987: 523-524.

[6]徐叔云,卞如濂,陈 修.药理学实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2003: 1651-1653.

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