PTEN和Livin在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

程 涛， 张建国， 王晓辉， 刘 刚， 王晓彬

肾细胞癌在泌尿系统恶性肿瘤中的发病率仅次于膀胱癌，居于第二位。其预后较差，并且对放化疗均不敏感。肾细胞癌的病理组织学类型分为：肾透明细胞癌，肾颗粒细胞癌和梭形细胞癌等。其中肾透明细胞癌发病率最高。PTEN和Livin都参与了细胞凋亡的调控。本实验通过免疫组化SP法检测PTEN和Livin在肾透明细胞癌、癌旁组织和正常肾脏组织中的表达，探讨两个因子在肾透明细胞癌发生、发展中的作用及两因子间的相互关系，以此为肾透明细胞癌的诊断、治疗及预后寻找一条新的途径。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取河南科技大学第一附属医院泌尿外科2010年4月至2011年5月手术切除并经病理证实的肾透明细胞癌标本50例，其中男30例，女20例；年龄36～74岁。组织学分级按Fuhrman法：Ⅰ级9例，Ⅱ级24例，Ⅲ级17例；临床病理分期按Robson分期法：Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ 期12例。其中发生淋巴结转移27例。同时选择癌旁非癌肾组织25例，正常肾组织10例作对照。所有入选患者在术前均未行放疗或化疗。

1.2 实验方法 石蜡包埋标本切片脱蜡和水化，应用免疫组化SP法，DAB显色。实验具体步骤参照试剂说明书进行。兔抗人PTEN单克隆抗体(浓缩型)，鼠抗人Livin单克隆抗体(浓缩型)及SP法免疫组织化学试剂盒购自福建迈新生物技术开发公司。PTEN和Livin一抗的浓度均是1∶100，用已知前列腺癌阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断 PTEN和Livin阳性表达均为在细胞质内见黄色或棕黄色颗粒。我们以染色强度及阳性细胞数综合判断。每例随机观察5个高倍镜视野(×400)，染色强度计分：0分无染色颗粒，1分有黄染细小颗粒，2分有较多黄色颗粒，3分有粗大棕黄色颗粒。阳性细胞百分比计分：0分无阳性细胞，1分1%～25%，2分26%～50%，3分51%～100%。并以两项相加得分>2分判为阳性，≤2分为阴性。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS17.0统计软件进行分析。统计方法应用χ2检验和Spearman等级相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN在肾透明细胞癌组织、癌旁组织及正常肾组织中的表达 PTEN蛋白阳性细胞定位于细胞质中，呈棕黄色颗粒。PTEN在50例肾透明细胞癌标本中阳性率明显低于癌旁及正常肾组织(P<0.01)(见表1) 。

表1 PTEN在肾癌组织、癌旁组织及正常肾组织中的表达比较

2.2 Livin在肾透明细胞癌组织、癌旁组织及正常肾组织中的表达 Livin蛋白阳性细胞定位于细胞质呈黄色颗粒。Livin在肾癌组织中的阳性表达率为44.0%，而在癌旁组织和正常肾组织中未见表达。其在癌组织中的阳性表达率与癌旁及正常肾组织比较均有显著性差异(χ2=20.78，P<0.01)。

2.3 PTEN, Livin阳性表达与肾透明细胞癌临床生物学特征间的关系 在组织病理学分级Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中PTEN的阳性表达率分别是77.8%、37.5%和23.5%，差异有统计学意义(P<0.05)。按临床分期，PTEN阳性表达率分别为Ⅰ期70.0%，Ⅱ期35.7%，Ⅲ～Ⅳ期16.7%，差异有统计学意义(P<0.05)。在有淋巴结转移组内阳性表达率20.0%，而在无淋巴结转移组表达率为53.3%，差异有统计学意义(P<0.05)。Livin在组织病理学分级Ⅲ级中阳性表达率(70.6%)高于Ⅰ级(11.1%)及Ⅱ级(37.5%)(P<0.01)；按临床分期，Ⅲ～Ⅳ期中阳性表达率(75.0%)显著高于Ⅰ期的10.0%及Ⅱ期的42.9%(P<0.01)；Livin在有淋巴结转移组阳性表达率(85.0%)高于无淋巴结转移组(16.7%)(P<0.05)，见表2。

2.4 肾透明细胞癌中PTEN和Livin的关系 在肾透明细胞癌PTEN阳性的20例标本中，Livin阳性有4例。而在PTEN阴性的30例标本中Livin阳性18例。经Spearman等级相关分析，PTEN和Livin表达呈显著负相关(rs=-0.395,P<0.01)，见表3。

3 讨论

近年来关于PTEN的研究逐渐成为热点。众所周知，PTEN是继P53之后在人类肿瘤当中缺失率和突变率最高的抑癌基因[1]。其定位于10q23，含9个外显子，编码一种有403个氨基酸的蛋白质，主要分布于细胞质中[2]。PTEN是一个有磷酸酶抑制活性的抑癌基因，其异常表达和突变与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，这一点已经被证实[3]。Brenner等[4]研究表明，PTEN在正常肾组织的近端肾小管上表达强阳性，而在远端肾小管上皮细胞没有或只有非常弱的表现。近端小管上皮细胞为最常见的肾脏恶性肿瘤的前体细胞。在近端小管上皮发现了PTEN的主要膜定位，这种膜的本地化损失可能会导致PTEN基因功能丧失。同时该研究还发现PTEN基因包含一个PDZ(PSD-q5, DLG, ZO-1)结合序列，鸟甘酸激酶(MAGE)2和3与上皮细胞紧密连接PDZ的结构域结合，从而调节AKT/PKB通路。Rasheed等[5]研究认为，PTEN的表达和组织学分级之间无相关性。G1期的肾透明细胞癌PTEN表达与他们的前体细胞(肾近端小管细胞)相比显著减少，但是从G2期到G3期没有观察到进一步下降，表明肿瘤抑制基因PTEN的损失是肾透明细胞癌的早期事件。

表2 PTEN，Livin表达与肾透明细胞癌临床生物学特征间的关系

表3 PTEN与Livin在肾透明细胞癌中表达的相关性

Livin在恶性肿瘤中的作用最早是在恶性黑色素瘤中提出来的。最近关于Livin的表达的研究已经在各种肿瘤中展开，如白血病、膀胱癌、肺癌、鼻咽癌、星形细胞瘤、恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌，肾癌等[6]。Livin是抑制凋亡蛋白(IAP)家族新成员，编码的蛋白质包括一个单一的杆状病毒IAP重复序列BIR域和羟基末端的环指结构域。Livin的环指结构域促进其自动泛素化，而BIR域可能显示退化的抑制活性。Livin BIR域的突变大大增加了其不稳定性，从而降低抗凋亡抑制。同时Livin的BIR域通过SMAC/DIABLO的负调控，在体外直接与Caspase-3和Caspase-7相互作用，与Caspase-9在体内作用抑制其酶水解作用，从而抑制细胞凋亡。Livin具有E3泛素连接酶活性，通过泛素-蛋白酶途径降低凋亡的关键调节步骤SMAC/DIABLO，从而抑制细胞凋亡[7]。

本实验研究结果显示，在50例肾透明细胞癌中Livin的阳性表达率是44.0%，而在正常肾组织及癌旁组织中无表达，差异有统计学意义(P<0.01)；PTEN在肾癌中的阳性表达率为40.0%，癌旁组织中为88.0%，在正常肾组织中则达100.0%，差异亦有统计学意义(P<0.05)。由表3我们得出两因子间呈显著的负相关性(P<0.01)。PTEN和Livin两因子在Ⅰ，Ⅱ期肾透明细胞癌的表达率与Ⅲ，Ⅳ期有显著差异，并且有无淋巴结转移间差异同样有显著性。此结果与国内李日恒等[8]对结直肠癌的研究结果相一致。此外，我们研究的结果显示两因子在肾透明细胞癌中的表达呈负相关关系，两者之间是否存在互相抑制的具体机制还有待进一步证实。

综上得出，PTEN和Livin与肾透明细胞癌的浸润、转移及预后有关，联合检测两个因子可对肾透明细胞癌的预后判断、生物学行为的判断提供可靠依据。同时也是检测肾透明细胞癌侵袭性的一个新指标。

[1] Huang J, Kontos CD. PTEN modulates vascular endothelial growth factor-mediated signaling and angiogenic effects[J]. J Biol Chem, 2002, 277(13):10760-10766.

[2] Li DM, Sun H. TEP1, encoded by a candidate tumor suppressor locus, is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta[J]. Cancer Res, 1997, 57(11):2124-2129.

[3] Hager M, Haufe H, Kemmerling R, et al. PTEN expression in renal cell carcinoma and oncocytoma and prognosis[J]. Pathology, 2007, 39(5):482-485.

[4] Brenner W, Färber G, Herget T, et al. Loss of tumor suppressor protein PTEN during renal carcinogenesis[J]. Int J Cancer, 2002, 99(1):53-57.

[5] Rasheed BK, Stenzel TT, McLendon RE, et al. PTEN gene mutations are seen in high-grade but not in low-grade gliomas[J]. Cancer Res, 1997, 57(19):4187-4190.

[6] 王秋. Livin在恶性肿瘤中的研究进展[J]. 肿瘤预防与治疗, 2011, 24(5): 250-253.

[7] Kasof GM, Gomes BC. Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family member[J]. J Biolchem, 2001, 276(5):3238-3246.

[8] 李日恒. LIVIN和PTEN在结直肠癌组织中的表达及意义[J].中国中西医结合急救杂志, 2009, 16(4):247-248.