人类乳腺癌组织中骨膜素的表达及其意义

张光远， 张亚男， 李俊生， 汤文浩

乳腺癌在我国的发病率逐年升高，特别是在北京、上海等发达城市已经成为危害妇女健康的主要恶性肿瘤。与其他恶性肿瘤相同，乳腺癌是多基因异常表达共同作用的结果。异常表达的基因参与乳腺癌的发生、发展与转移的各个环节，起着重要的生物学作用。骨膜素(periostin, PN)因其在骨膜和牙周韧带中表达而被命名。PN是一种在结构和序列上与昆虫细胞粘附分子(束素-Ⅰ，一种轴突导向蛋白)具有同源性的蛋白质，由4个重复的含120～160个氨基酸的结构域组成，含这种结构域的蛋白通常发挥粘附分子的作用[1]。近年来发现PN在多种肿瘤组织中高表达，如结肠癌、非小细胞肺癌等[2-3]。本研究旨在探讨PN在乳腺癌组织中的表达情况及意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

1.1.1 供RT-PCR和Western-Blot法检测标本 2005年3月至2005年9月东南大学附属中大医院普外科切除乳腺癌组织标本及相应病例正常乳腺新鲜组织标本各5例，均为女性，中位年龄44岁，冻存于-80℃冰箱，癌组织均为浸润性导管癌，临床分期均为Ⅱ期。

1.1.2 供免疫组织化学法检测标本 2003年至2005年中大医院普外科切除乳腺癌组织标本及乳腺纤维腺瘤组织标本石蜡块51例，均为女性，年龄25～74岁，中位年龄56岁。其中，乳腺纤维腺瘤9例；浸润性导管癌33例，黏液腺癌9例。按照国际抗癌协会推荐的TNM分期(1988年修订)Ⅰ期15例，Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期10例；有淋巴结转移6 例。以上标本均经中大医院病理科病理诊断确认。

1.2 主要试剂

TRNzol总RNA提取试剂盒(北京天为时代科技有限公司)，通用两步法RT-PCR试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)，兔抗人periostin抗体(Abcam公司，英国)，羊抗兔HRP二抗 (南京大治生物科技有限公司)， Envision system HRP鼠/兔免疫组化二抗试剂盒(Gene公司，中国香港)，显色试剂DAB(北京中杉生物科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) (1)总RNA提取。称取50～100 mg标本组织，用玻璃组织匀浆管冰上快速匀浆，参照TRNzol试剂说明书进行提取；提取的两种组织的总RNA经快速琼脂糖凝胶电泳可见18S、28S两条清晰条带，紫外分光光度法测定RNA浓度OD260/OD280在1.8～2.0之间，提示其完整性和纯度符合实验要求。(2)操作步骤。操作参照通用两步法RT-PCR试剂盒使用说明书进行。PN扩增产物的长度为193 bp，PN引物：上游引物5′-GCCATCACATCGGACATA-3′，下游引物5′-CTCCCATAATAGACTCAGAACA-3′；β-actin扩增产物长度为621 bp，β-actin引物：上游引物5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3′，下游引物5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。以上引物均由上海申工生物科技有限公司设计并合成。循环参数为：94℃ 2 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min (32个循环)，72℃ 8 min。(3)产物的鉴定与定量。取5 μL PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果应用Image MASTER凝胶成像仪紫外光下照相，用Labimage图像分析软件对目的基因和β-actin电泳条带分别进行亮度面密度值分析，以两者比值反映目的基因在组织中的表达水平。

1.3.2 Western-Blot (1) 蛋白提取并测定浓度。称取100 mg标本组织加1 mL组织细胞裂解液低温快速匀浆，4℃下10 000 g离心1 min，取上清；应用紫外分光光度法测定蛋白浓度。(2) 反应步骤。取大约100 μg蛋白经10% SDS-PAGE凝胶恒压100 V电泳分离，然后电转移(50 V， 2 h)至硝酸纤维素膜(NC膜)上，5%脱脂奶粉-PBST封闭液室温下封闭1 h，PBST洗膜，含一抗的5%脱脂奶粉-PBST溶液(1∶500) 4℃孵育过夜，PBST洗膜，二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，PBST洗膜后加DAB显色15 min，自来水终止反应。(3) 结果分析。用Image MASTER凝胶成像仪照相，结果应用Labimage图像分析软件分析。

1.3.3 免疫组织化学染色 (1)石蜡切片厚度约4 μm，常规水化，PBS冲洗3次× 3 min，柠檬酸组织抗原修复液抗原修复，加50 μL兔抗PN一抗(1∶100)室温下孵育1 h，PBS冲洗3次×5 min，甩去PBS，加50 μL适当浓度的二抗，室温下孵育10～15 min，除去PBS加两滴新鲜配制的DAB显色4 min，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，水冲洗；切片用酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，对切片拍照。(2)结果判定根据棕色反应的阳性强度、面积阳性强度及面积判断结果。半定量评分标准为：每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别记为0、1、2、3分，着色阳性面积按无着色、着色<1/3、1/3～2/3、>2/3 分别记为0、1、2、3分，然后根据两项记分之和判断其结果。

1.4 数据处理

RT-PCR及Western-Blot结果用Labimage图像分析软件进行光密度×面积分析，数据处理采用t检验。应用统计软件SAS 8.0进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PN mRNA在乳腺癌组织中的表达

如图1所示，PN在癌组织(C)中mRNA水平上表达量较正常组织(N)明显升高。两者平均表达量分别为1.623±0.109，0.728±0.063，上调约2倍，经t检验，P<0.05，两者差异有统计学意义。

图1 PN mRNA在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达差异

2.2 PN蛋白在乳腺癌组织中的表达

PN在癌组织(C)中较正常乳腺组织(N)表达明显增高(图2)，两者平均值分别为0.983±0.088，0.474±0.049(图3)，经t检验P<0.05，两者差异有统计学意义。此结果与RT-PCR结果一致。

2.3 PN表达水平与乳腺癌进展的关系

免疫组化结果显示PN蛋白主要在乳腺癌组织的间质中表达，而癌细胞胞膜、胞质中则为阴性(图4B～E，图4A为阴性对照)。PN在正常淋巴结中表达呈阴性(图4F)，在乳腺纤维腺瘤组织中表达也为阴性(图4G)。随着肿瘤TNM临床分期增高而PN表达评分增高(表1)；而在6 例淋巴结转移患者中PN表达均呈阳性，且在胞质中有表达(图4 H)。

图2 PN蛋白在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达差异

图3 乳腺癌组织及正常组织中PN蛋白表达水平示意图

表1 各临床分期组免疫组化半定量评分

图4 以PN为指标的免疫组化染色：A为阴性对照；B～E分别为临床分期Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌组织；F为正常淋巴结；G为乳腺纤维腺瘤组织；H为转移淋巴结(×400)

3 讨论

现有的研究表明PN在成人的多种正常组织中都有基础的表达，其中就包括乳腺组织。Tai等[2]发现，PN蛋白可促进体外培养的结肠癌细胞的增殖；Gillan等[4]在对卵巢癌的研究中发现，卵巢癌上皮细胞分泌的PN可以增强癌细胞的活动性和侵袭能力；Bao等[5]提出PN促肿瘤的机制为PN是作为αvβ3整合素或αvβ5整合素的配体激活Akt/PKB信号传导通路从而促进了肿瘤细胞的存活。

在我们的研究中发现，正常乳腺组织中PN有一定的基础表达，提示其有一定的生理作用；PN在乳腺纤维腺瘤组织中表达阴性，这可能是因为乳腺纤维腺瘤起源于乳腺小叶中特化的纤维组织而与正常的乳腺组织有所差异；在乳腺癌组织中PN的表达在mRNA水平和蛋白水平都上调，并且随着临床分期增高而表达增高；在转移性淋巴结中发现PN的阳性表达。因此可以认为，在乳腺癌中高表达的PN有重要的生物学作用，其可能参与乳腺癌的病理进展过程，并且与乳腺癌的淋巴结转移有关。在免疫组化的结果中，PN主要在乳腺癌组织的间质中表达，而癌细胞的胞膜和胞质均为阴性。另外，本研究还发现在转移性淋巴结中PN在癌细胞的胞质中也有表达，Tai等[2]在继发于结肠癌的肝转移的免疫组化研究中也得到类似结果。对此我们认为可能的原因为：转移性肿瘤与原发性肿瘤相比较处于相对恶劣的新生环境，需要有更强的增殖能力和侵袭能力，而PN增强肿瘤细胞增殖能力和侵袭能力，是转移性肿瘤生长所必需的蛋白分子，转移性肿瘤细胞大量分泌PN，因此在胞质中可见到处于分泌期的PN蛋白。

然而也有学者发现PN表达在某些肿瘤如膀胱癌中下调，并且转染PN后膀胱癌细胞的浸润与转移能力下降，即PN在膀胱癌中可能起到抑制浸润与转移的作用[6]。这提示PN在不同的组织中有不同的生物学作用，其作用是复杂的、多方面的，具体有待进一步研究。在本研究中，PN在乳腺癌中高表达，并且表达量与临床分期呈正相关，表明其参与了乳腺癌的发生发展过程。

[1] 杨诚, 沈锋. Periostin对肿瘤转移和浸润的影响[J]. 中国肿瘤外科杂志, 2010, 2(1): 39-41.

[2] Tai IT, Dai M, Chen LB， et al. Periostin induction in tumor cell line explants and inhibition of in vitro cell growth by anti-periostin antibodies[J]. Carcinogenesis, 2005, 26(5):908-915.

[3] Sasaki H, Dai M, Auclair D, et al.Serum level of the periostin, a homologue of an insect cell adhesion molecule, as a prognostic marker in nonsmall cell lung carcinomas[J]. Cancer, 2001, 92(4):843-848.

[4] Gillan L, Matei D, Fishman DA, et al. Periostin secreted by epithelial ovarian carcinoma is a ligand for alpha(V)beta(3) and alpha(V)beta(5) integrins and promotes cell motility[J]. Cancer Res, 2002, 62(18):5358-5564.

[5] Bao S, Ouyang G, Bai X, et al. Periostin potently promotes metastatic growth of colon cancer by augmenting cell survival via the Akt/PKB pathway[J]. Cancer Cell, 2004, 5(4):329-339.

[6] Kim CJ, Yoshioka N, Tambe Y, et al. Periostin is down-regulated in high grade human bladder cancers and suppresses in vitro cell invasiveness and in vivo metastasis of cancer cells[J]. Int J Cancer, 2005, 117(1):51-58.