山核桃叶提取物的抗氧化活性比较

何志平庞林江茅林春孙佳丽

（1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310029）

山核桃叶提取物的抗氧化活性比较

何志平1，2庞林江1茅林春2孙佳丽1

（1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310029）

采用1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、还原能力、超氧阴离子清除能力评价不同山核桃叶提取液的抗氧化活性，采用Folin酚法测定提取液的总酚质量浓度。结果表明，山核桃叶提取物具有较强的抗氧化活性，并以甲醇和蒸馏水提取物的抗氧化活性最强；60%甲醇溶液的提取物具有最高的DPPH自由基清除能力，总酚得率最高，达到（10.63±0.31）mg／g山核桃叶。

山核桃叶；抗氧化；总酚；提取液

山核桃与核桃一样，同属胡桃科木本植物，主要分布于浙、皖两省交界的天目山区周围，仅浙江省山核桃面积就超过417万hm2。目前，山核桃的开发主要围绕其果仁、果壳、外果皮进行［1－2］：王冀平等［3］发现山核桃果仁中不饱和脂肪酸含量高达61.69%～70.89%；房祥军等［4］发现果仁中多酚含量为4.71%。丁之恩等［5］利用微波－催化剂法成功制备出山核桃壳活性炭；林君阳等［6］发现外果皮具有较强的抑菌活性；刘元慧等［7］对外果皮的化学成分进行了研究，从中分离鉴定出了12种化合物。然而，针对中国山核桃叶的研究，尤其是山核桃叶的抗氧化活性和化学成分研究还未见报道。在欧洲，人们将核桃叶提取物作为治疗静脉功能不全、痔病等疾病的传统药物［8］。许多研究［9］证实核桃叶具有消炎、抗癌以及降血糖、降血压等生理活性。据报道［10］，核桃叶中含有多种酚类化合物如萘醌类及其衍生物、黄酮类、二芳基庚烷类化合物、大量鞣质等。Pereira等［11］利用反相高效液相色谱法鉴定了不同品种核桃叶中含有的10种酚类化合物，并且发现6个不同品种核桃叶都具有较高的抗氧化能力和抑菌能力。Amaral等［12］发现核桃叶中主要酚类为金丝桃苷，其次为4－肉桂酰奎尼酸，他们还发现不同季节的核桃叶中的总酚含量也有明显的变化，其中以五月份的含量最高。Almeida等［8］在体外试验中发现核桃叶提取物能有效清除活性氧族和活性氮族自由基。

本试验采用不同极性的提取溶剂分别对山核桃叶进行抽提，并对各提取物的体外抗氧化、总酚含量进行测定研究，以期为山核桃叶的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃叶（Carya cathayensis Sarg.）：9月中旬采摘于浙江临安昌化，树龄为10年，叶子着生于叶轴中端，颜色青，无机械损伤、无褐斑和病虫害的叶子作试验材料。

1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH），没食子酸，L－抗坏血酸：美国Sigma公司；

抗超氧阴离子自由基测试盒：南京建成生物工程研究所；

其他试剂：均为市售分析纯。

1.2 主要仪器设备

电热恒温鼓风干燥箱：DGG－9053AD型，上海福玛实验设备有限公司；

数显恒温水浴锅：HH4，国华电器有限公司；

超声波清洗器：KQ－500B，昆山市超声仪器有限公司；

可见分光光度计：722型，上海光谱仪器有限公司；

冷冻离心机：GL－20G－Ⅱ，上海安亭科学仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理 将采集的山核桃叶用清水洗净，在30℃ 下用电热恒温鼓风干燥箱干燥60 min，然后在研钵中利用液氮将叶子研磨粉碎，过60目筛，冻干后将叶子粉装于密封塑料袋中，置于－20℃冰箱中备用。

1.3.2 提取液制备 称取0.5 g核桃叶粉装于50 m L离心管中，分别加入蒸馏水、甲醇、丙酮、异丙醇、石油醚20 m L，在室温放入超声波清洗器中提取30 min，然后使用冷冻离心机内以1 000 g的速度离心8 min，取出上清液，作抗氧化指标和总酚测定。提取液质量浓度以每毫升提取液中新鲜叶子的添加质量来计算。

1.3.3 DPPH自由基清除能力测定 取一定量提取液至离心管中，加提取剂补足至200μL（最终质量浓度为0.3，0.6，1.2 mg／m L），再加入3.8 m L DPPH（0.04 mg／m L）溶液中，震荡摇匀，在30℃的水浴锅中遮光30 min，517 nm测定吸光值。提取物清除DPPH自由基清除能力（DPPH Scavenging Activity，DSA）按式（1）计算：

式中：

DSA——提取物清除DPPH自由基清除能力，%；

A——样品液与DPPH溶液混合后的吸光度；

A0——无水乙醇代替样品测得的吸光度。

1.3.4 还原能力测定 取一定量提取液至离心管中，加提取剂补足至1 m L（最终质量浓度为5，10，15，20 mg／mL），再加2.5 mL 的磷酸缓冲液（0.2 mol／L，p H 6.6）和2.5 m L K3Fe（CN）6（0.03 mol／L），并在50 ℃烘箱内培养20 min。随后加入2.5 m L 10%三氯醋酸，1 000 g离心10 min。取上清液2 m L，加入到2.5 m L蒸馏水和0.5 m L 0.006 mol／L的FeCl3体系中反应10 min，以空白为参照，在700 nm下测吸光值，吸光度越大则样品的还原能力越强［13］。

1.3.5 超氧阴离子清除能力测定 采用抗超氧阴离子自由基测试盒［14］。将各提取液稀释成6.25μg／m L的待测液，取120μL进行试验，检测各提取物对超氧阴离子自由基的抑制率，试验重复3次。以VC为标准样，制作VC抑制超氧阴离子能力标准曲线，当VC质量浓度在0.02～0.1 mg／mL时，VC含量与超氧阴离子抑制率成线性关系（y＝7.740 5x＋0.009 3，y为抑制率，x为VC含量）。抗超氧阴离子自由基活力单位的定义：在反应体系中，每升提取液或每克核桃叶提取物在37℃反应40 min所抑制的超氧阴离子自由基相当于1 mg的VC所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为1个活力单位。

1.3.6 总酚含量的测定 取0.1 m L提取液原液至离心管中，稀释至1 m L，加入1 m L稀释两倍的福林酚试剂（2 N），3 min后加入3 m L 2%碳酸钠，25℃避光放置2 h后765 nm测定吸光值。以没食子酸作为标准样，制作标准曲线，总酚含量以没食子酸当量来计算。提取液中的总酚含量以每毫升中总酚的没食子酸当量来计算，山核桃叶总酚含量以每克山核桃叶提取得到的总酚没食子酸当量来计算［15］。

2 结果与分析

2.1 提取剂对提取液清除DPPH自由基能力的影响

核桃叶提取液质量浓度为0～0.5 mg／mL时，对DPPH自由基的清除率具有量效关系见图1，DPPH自由基清除率随着提取液质量浓度增加而提高。提取液质量浓度为0.3 mg／mL时，5种提取液DPPH自由基清除率如图1所示。对DPPH自由基清除率的大小排序为：蒸馏水＞甲醇＞丙酮＞异丙醇＞石油醚。蒸馏水相清除能力最高，与其他4种不同提取液存在显著性差异（P＜0.01）。石油醚相最低，后续试验中石油醚提取液不再检测。

图1 提取剂对核桃叶清除DPPH自由基的影响Figure 1 The effect of different extractant on DPPH radical scavenging activity of chinese hickory leaves

2.2 提取剂对提取液还原力的影响

在核桃叶提取液质量浓度为0～25 mg／m L时，核桃叶提取液质量浓度与还原力具有量效关系，还原力大小随着提取液质量浓度增加而提高。提取液质量浓度为15 mg／mL时，4种提取液的还原力如图2所示，还原力顺序为甲醇＞蒸馏水＞丙酮＞异丙醇。甲醇相还原力最高，与其他4种不同提取液存在显著性差异（P＜0.05）。异丙醇相最低。

图2 提取剂对核桃叶还原力的影响Figure 2 The effect of different extractant on reducing power of chinese hickory leaves

2.3 提取剂对提取液抑制超氧阴离子能力的影响

试验结果显示，核桃叶提取液质量浓度为0～12.5μg／mL时对抑制超氧阴离子具有量效关系，超氧阴离子抑制率随着提取液质量浓度增加而提高。当提取液质量浓度为6.25μg／m L时抑制超氧阴离子能力见表1。由表1可知各提取相中，甲醇相和蒸馏水相要比丙酮相和异丙醇相高（P＜0.01），甲 醇 相 和 蒸 馏 水 相 之 间 无 显 著 差 异（P＞0.05）。

表1 提取剂对核桃叶提取液抑制超氧阴离子的影响+Table 1 The effect of different extractant on superoxide anion scavenging activity of chinese hickory leaves（mean±SD）

2.4 提取溶剂对总酚提取得率的影响

试验中，甲醇、丙酮、异丙醇、蒸馏水4种溶剂对山核桃叶总酚提取得率见表2（以干基计）。提取得率均介于0.94和1.01之间，提取得率最高的是甲醇提取液；其次是水提液和丙酮提取液；最低为异丙醇提取液。

2.5 甲醇体积分数对提取液清除DPPH自由基能力的影响

从2.1～2.4试验中可以发现，甲醇提取液和蒸馏水提取液相比其他提取相来讲，清除DPPH自由基的能力、还原力、抑制超氧阴离子的能力以及总酚提取得率均最高。为进一步优化甲醇与蒸馏水的提取效果，以清除DPPH自由基为指标，考察甲醇与水的比率对核桃叶清除DPPH自由基的影响，结果见图3。在甲醇体积分数为0%～60%时，DPPH自由基清除率随着甲醇体积分数增加而变大。在甲醇体积分数为60%时，DPPH自由基清除率最高，达77.7%，然后逐渐减小。这说明60%的甲醇水溶液最适宜提取山核桃叶中的清除DPPH自由基的抗氧化物。在该条件下，测得总山核桃叶总酚含量为（10.63±0.31）mg／g。

表2 不同提取溶剂的总酚提取得率Table 2 Extraction yield（in percentage）and total phenols contents in the extracts of the different solvents of the Carya cathayensis leaves（mean±SD）

图3 甲醇体积分数对甲醇水提取液清除DPPH自由基的影响Figure 3 The effect of concentration of methanol water solution on DPPH radical scavenging activity of chinese hickory leaves

2.6 核桃叶多酚与抗氧化活性相关分析

相关性分析表明，总酚含量与超氧阴离子自由基抑制率、还原力之间存在显著正相关 （R＝0.89，P＜0.05；R＝0.90，P＜0.05）而与DPPH自由基清除率相关性不显著（R＝0.69，P＞0.05）。说明多酚是核桃叶抑制超氧阴离子自由基和提供还原力的主要成分，而且核桃叶还存在有清除DPPH自由基的其他成分，具体物质还有待进一步分析。

3 讨论

本试验证实，经甲醇、蒸馏水、丙酮、异丙醇萃取后获得的山核桃叶提取液均具有一定的抗氧化活性。甲醇相、蒸馏水相的清除DPPH自由基能力、还原力、抑制超氧阴离子能力要高于丙酮相、异丙醇相。进一步的优化试验表明，60%甲醇溶液的提取物具有最高的DPPH自由基清除能力，总酚得率最高，达到（1.01±0.02）%。此时计算的山核桃叶的多酚含量为（10.63±0.31）mg／g山核桃叶。由于不同提取溶剂所得的提取相中酚类物质有明显的差异，在以后的试验中，可以采用先用甲醇提取，然后用其他有机溶剂如氯仿等进行二次浸提，从而提高山核桃叶的总酚提取得率。

对于山核桃叶来讲，不同品种、采收季节对叶中总酚含量的影响以及酚类化合物的鉴定还有待进一步开展。本试验证实山核桃叶与核桃叶（Juglans regia L.）一样，也具有良好的抗氧化功能和丰富的多酚类物质。本试验的研究结果揭示了山核桃叶具有良好的开发前景。

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Antioxidant activities in the extracts from Chinese hickory（carya cathayensis sarg.）leaves

HE Zhi－ping1，2PANG Lin－jiang1MAO Lin－chun2SUN Jia－li1

（1.School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A ＆ F University，Hangzhou，Zhejiang311300，China；2.College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang310029，China）

The effect of different solvent on antioxidant activities and total phenolic content of extracts of Chinese hickory leaves was investigated in this work.Several methods for determining antioxidant activities of the samples were employed included DPPH radical scavenging activity，reducing power and superoxide anion scavenging activity.The total phenolic was determined by folin phenol agent.The results showed that all extracts provided various antioxidant activities and methanol and water extracts possessed the highest effect.the optimum concentration of methanol water solution for the extract with highest DPPH elimination was 60%.The sanll effect of different solvent on total phenolic content of extracts was also founded in this research.The highest extraction yield of total phenolic was 10.09±0.24 mg gallic acid equivalents／g of fresh leaves in methanol extract.

Chinese hickory leaves；antioxidant；total phenolic；extract

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.014

浙江省自然科学基金项目（编号：Y3090428；Y3100422；Y3110340）

何志平（1977－），男，浙江农林大学讲师，博士研究生。E－mail：hzhping＠163.com

茅林春

2011－01－31