黑木耳多糖的羧甲基化及其对肝癌细胞Hep G2的抑制作用

张 华王振宇，2杨 鑫杨 林王 雪

（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090；2.东北林业大学，黑龙江 哈尔滨150040；3.德之馨（上海）有限公司，上海 201206）

黑木耳多糖的羧甲基化及其对肝癌细胞Hep G2的抑制作用

张 华1王振宇1，2杨 鑫1杨 林1王 雪3

（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090；2.东北林业大学，黑龙江 哈尔滨150040；3.德之馨（上海）有限公司，上海 201206）

对提取分离的黑木耳多糖进行羧甲基化，并对人体肝癌HepG2细胞株进行干扰研究，探讨其增殖抑制作用。将HepG2细胞进行贴壁培养，对处在对数生长期的HepG2细胞进行对照试验。结果表明，黑木耳中性多糖组、黑木耳酸性多糖组对HepG2细胞毒试验得到细胞存活率50%时的药物浓度范围在200～600μg／m L。两种未经羧甲基化改性的黑木耳多糖在体外对人HepG2细胞具有抑制作用，而经羧甲基化改性的黑木耳多糖则没有。

黑木耳酸性多糖；羧甲基化黑木耳酸性多糖；黑木耳中性多糖；羧甲基化黑木耳中性多糖；肝癌细胞HepG2；体外试验

黑木耳（auricularia auricular）属于真菌门担子菌纲木耳目木耳科，是中国重要的药食兼用真菌［1］，黑木耳多糖具有调节人体免疫系统、降血脂、抗肿瘤、抗辐射、增强肠胃功能和护肝等功效［2－4］。

多糖分子中的取代基对多糖的活性影响很大，因此对多糖进行结构改造有望得到活性更强、应用范围更广的多糖衍生物［5］。多糖羧甲基化能增大多糖溶解度和电负性，可以提高多糖的水溶性，能给多糖增强或增添新的活性［6－9］，因其具有制备过程简单、试剂成本低及生成物无毒性等优点，已成为一种较常用的多糖衍生化方法［10］。

癌症是严重危害人类健康的疾病，从天然产物中寻找预防和治疗恶性肿瘤的活性成分始终是药物化学家研究的热点之一［11］。本试验通过水提醇沉得到黑木耳粗多糖，经十六烷基三甲基溴化铵分级得到黑木耳酸性多糖（AAAP）和黑木耳中性多糖（NAAP），并制备羧甲基化衍生物，用红外光谱（FTIR）对其结构进行表征后，进一步验证4种黑木耳多糖对人肝癌Hep G2细胞增殖的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

黑木耳：产自黑龙江省大兴安岭，市售。

1.1.2 试剂

二甲基亚砜（DMSO 溶液），3－（4，5二甲基噻唑－2）－2，5二苯基四甲基溴化铵（thiazolyl blue，MTT）：美国西格玛化工有限公司；

DMEM培养基：赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司；

胎牛血清：杭州四季青有限公司；

青链霉素：北京索莱宝科技有限公司；

其他试剂：均为分析纯。

1.1.3 细胞株

肿瘤细胞株、人肝癌细胞株Hep G2：由哈尔滨医科大学附属肿瘤医院细胞库提供。培养要求：贴壁培养。

1.2 主要仪器

高速万能粉碎机：FW100，天津市泰斯特仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司；

真空冷冻干燥机：DS－1，北京博医康实验仪器有限公司；

超声波细胞粉碎机：JY92－Ⅱ，宁波新芝生物科技股份有限公司；

红外光谱仪：FTIR，美国珀金埃尔默公司；

酶标仪：BIO－RAD 550，美国伯乐公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑木耳多糖的制备 将黑木耳清洗、除杂、干燥、粉碎后过40目筛，制成黑木耳干粉，采用石油醚进行脱脂处理，脱脂后的粉末用95%乙醇进行索氏提取脱去低聚糖，晾干，备用。准确称取黑木耳干粉，按60∶1（V∶m）液料比加入蒸馏水浸泡后进行超声辅助萃取处理，然后沸水浴浸提5 h，提取液以4 500 r／min离心10 min，残渣再提取2次。合并上清液，减压浓缩，3倍体积的95%乙醇醇沉，静置过夜。4 500 r／min离心15 min，收集沉淀加蒸馏水溶解，乙醇沉淀4 500 r／min离心15 min，重复3次。最终将所得沉淀加入少量蒸馏水溶解，流水透析72 h以除去乙醇及其他小分子杂质，透析后清液经减压浓缩后，真空冷冻干燥制得黑木耳粗多糖。

1.3.2 脱色及去除小分子 配制浓度0.5%的黑木耳多糖粗糖液，滴加3%的双氧水，45℃水浴中保温3 h，逆水流自来水透析48 h，蒸馏水透析24 h，减压浓缩，3倍体积的95%乙醇醇沉，静置过夜后4 500 r／min离心15 min，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥，制得黑木耳精多糖。

1.3.3 黑木耳酸性多糖和中性多糖的制备 黑木耳中性多糖和酸性多糖分别为黄白色纤维状和黄褐色晶体状物质，室温下能溶于水，易溶于热水，水溶液呈透明状。将脱色后的黑木耳精多糖配制成浓度为0.5%的多糖液，加入一定体积的0.5%十六烷基溴化三甲胺（CTAB）溶液，酸性多糖与CTAB作用形成不溶于水的沉淀，4 500 r／min离心15 min，将得到的沉淀溶解于100 m L 4 M的NaCl中，静止过夜，4 500 r／min离心10 min，得到的清液置于3 500 Da透析袋中自来水透析72 h，蒸馏水透析48 h，减压浓缩后，3倍体积的95%乙醇醇沉，冷冻干燥得黑木耳酸性多糖；中性多糖则留在母液中，经透析、浓缩、醇沉而分离。

1.3.4 羧甲基化黑木耳多糖的制备 多糖羧甲基化反应机理见图1。称取经CTAB分级得到的黑木耳酸性多糖和中性多糖各1 g，分别分散于30倍的异丙醇中，室温下搅拌6 h，加入40倍60%（m／V）的NaOH溶液，于85℃水浴回流1.5 h，在15 min内加入60倍60% （m／V）的氯乙酸，混合物于65℃恒温反应4 h，并不断搅拌，反应结束后，冷却至室温，反应液用5 mol／L盐酸调至中性，过滤，滤液用流动水透析3 d，蒸馏水透析1 d，浓缩，用甲醇醇沉，沉淀由甲醇∶水＝1∶1洗涤数次，冷冻干燥得羧甲基化的黑木耳酸性多糖（CMC AAAP）和中性多糖（CMC NAAP）［8］。

图1 多糖羧甲基化反应机理Figure 1 Reaction mechanism of carboxymethylation polysaccharide

1.3.5 羧甲基化黑木耳多糖的红外光谱分析 取羧甲基化的黑木耳酸性多糖和中性多糖样品1 mg，KBr压片，扫描4 000～400 cm－1的红外光谱。

1.3.6 细胞增殖试验 细胞增殖试验用 MTT法进行测定［12－13］。取对数生长期HepG2肿瘤细胞，在96孔细胞培养板每孔加入4×105cells／mL 100μL培养24 h。待细胞贴壁后调整黑木耳酸性多糖、羧甲基化黑木耳酸性多糖、黑木耳中性多糖和羧甲基化黑木耳中性的终浓度分别为50，100，150，200，250，300，400，500μg／mL，每个浓度及对照均设6个复孔。以加有细胞而不含药物的培养液孔为对照孔。用酶标仪测定各孔吸光值，计算4种黑木耳多糖不同浓度对Hep G2肿瘤细胞增殖抑制率。抑制率按式（1）计算：

以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率，运用CalcuSyn DEMO软件求出药物半数抑制浓度（IC50）。

2 结果和讨论

2.1 羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖制备

采用异丙醇为反应媒介，用NaOH水溶液作为碱，以ClCH2COOH为羧甲基化试剂，对黑木耳酸性多糖和黑木耳中性多糖进行羧甲基化，羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖的得率分别为22.26%和19.12%。

2.2 羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖的红外光谱分析

羧甲基化后黑木耳多糖的水溶性明显增强，FTIR分析表明，羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖具有多糖类物质的特征吸收峰，其中3 600～3 200 cm－1区域的吸收峰为糖的特征吸收峰，是由羟基O－H的伸缩振动引起的，表明存在分子间和分子内氢键；3 000～2 800 cm－1区域的吸收峰也为糖的特征吸收峰，是由次甲基C－H的伸缩振动引起，表明有－CH2基存在，这两组峰可以初步判断该样品是糖类化合物［14］。

由图2、3可知，羧甲基化黑木耳酸性多糖在1 613，1 416，1 324 cm－1处出现了－COO－的特征吸收峰，而羧甲基化黑木耳中性多糖在1 613，1 423，1 324 cm－1处出现了－COO－的特征吸收峰，表明这两种黑木耳多糖已忧功羧甲基化。

图2 黑木耳酸性多糖和羧甲基化黑木耳酸性多糖红外光谱图Figure 2 FTIR spectra of AAAP and CMC AAAP

图3 黑木耳中性多糖和羧甲基化黑木耳中性多糖红外光谱图Figure 3 FTIR spectra of NAAP and CMC NAAP

2.3 黑木耳多糖和羧甲基化黑木耳多糖对HepG2细胞的抑制作用

不同浓度的羧甲基化黑木耳酸性多糖和黑木耳酸性多糖对HepG2细胞的抑制作用试验结果表明：未羧甲基化的黑木耳多糖对Hep G2细胞的抑制作用明显高于羧甲基化的（见图4）；当黑木耳酸性多糖浓度为400μg／m L时，对Hep G2癌细胞的抑制率达到最大为50.08%；羧甲基化黑木耳酸性多糖对HepG2癌细胞的最大抑制率仅为17.56%；随着黑木耳中性多糖浓度的增高，对Hep G2癌细胞抑制率明显增加，而羧甲基化黑木耳中性多糖对Hep G2细胞则没有抑制作用（见图4）。提示这种取代度的黑木耳中性多糖对肝癌细胞HepG2没有直接杀伤作用，也表明羧甲基化黑木耳中性多糖在细胞水平上对细胞无明显毒性。经calcusyn软件分析得到黑木耳酸性多糖IC50值578.08μg／m L，而黑木耳中性多糖IC50值218.90μg／m L，因此黑木耳中性多糖对HepG2的抑制作用要高于黑木耳酸性多糖。体外抗氧化试验结果表明：黑木耳中性多糖清除羟基自由基和超氧自由基的活性比黑木耳酸性多糖高。

图4 黑木耳酸性多糖和羧甲基化黑木耳酸性多糖对肝癌Hep G2的抑制作用Figure 4 Inhibition of HepG2 of CMC AAAP and AAAP

3 结论

（1）黑木耳多糖用氯乙酸钠改性后，羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖的得率分别为22.26%和19.12%，红外光谱表征这两种多糖已羧甲基化。

（2）通过对改性多糖的Hep G2的体外抑制增殖试验，发现改性后的羧甲基化黑木耳多糖对Hep G2的体外抑制增殖作用反而不如未经改性的黑木耳多糖，黑木耳中性多糖对HepG2增殖的抑制作用要高于黑木耳酸性多糖。

今后的研究应结合羧甲基化后黑木耳多糖的羧甲基取代度：考虑制备更低取代度的样品并测试其抑癌活性；进一步研究其体外抗氧化活性并筛选羧甲基化黑木耳多糖其它生物活性，如抗病毒活性、抗辐射作用。

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In vitro antitumor activities of carboxymethylated derivatives of polysaccharides extracted fromauricularia auricula

ZHANG Hua1WANG Zhen－yu1，2YANG Xin1YANG Lin1WANG Xue3

（1.Shool of Food Science and Engneering，Harbin Institute of Technology，Harbin，Heilongjiang150090，China；2.Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang150040，China；3.Symrise（Shanghai）Co.，Ltd.，Shanghai201206，China）

Cancer has been a challenge for humanity.Many scientific researchers have been exploring antitumor activities of some natural products.It was reported that polysaccharide had good antitumor activities.This paper reports on a water－soluble polysaccharide（AAP）and in how it was ultrasound－assisted and extracted fromAuricularia auricularand fractioned by Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide（CTAB）.Then these two carboxymethylated polysaccharides（acidic polysaccharide，AAAP and neutral polysaccharide，NAAP）were prepared.Additional further explanation is given as to their structural characteristics by Fourier transform infrared spectrometer（FT－IR）.And then inhibition of on the human HepG2 cell proliferation was studied.The results showed toxicity experiments 50%viability of concentrations between the neutral polysaccharide fromAuriculariaand acidic polysaccharide fromAuriculariaon HepG2 cell was range 200 to 600μg／m L.These two polysaccharides fromAuriculariawhich have the potential medicinal value in inhibiting on human Hep G2 cells in vitro，are well worth further studying.

acidauricularia auricularpolysaccharide（AAAP）；carboxymethylated acidauricularia auricularpolysaccharide（CMC AAAP）；neutralauricularia auriculapolysaccharide（NAAP）；carboxymethylated neutralauricularia auriculapolysaccharide（CMC NAAP）；HepG2；in vitro

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.013

国家高新技术研究发展计划（863计划）（编号：2007AA100404）

张华（1977－），女，哈尔滨工业大学讲师，在读博士。E－mail：zhhua＠hit.edu.cn

王振宇

2011－03－01