产紫红色素菌株的筛选及诱变

胡博涵刘素纯何 理李海飞

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；4.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）

产紫红色素菌株的筛选及诱变

胡博涵1刘素纯2，3何 理4李海飞1

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；4.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）

以土壤和3种水果为样品，马铃薯－抗生素培养基为基质，采用稀释平板法分离产紫红色素的菌株，并以产紫红色素菌株为出发菌株进行紫外诱变。结果表明：从苹果表面上获得1株产紫红色素的真菌，通过个体形态和菌落特征初步分析为镰孢菌属菌株（fusarium sp.），该菌以马铃薯－蔗糖（35%）为基质发酵，获得胞内紫红色素OD值为0.790，胞外色素OD值为0.538，该突变菌株获得其胞内紫红色素OD值为0.895，胞外色素OD值为0.503，且该突变菌株产生色素的速度要快于出发菌株1 d。

紫红色素；OD值；诱变

科技的发展使合成色素在食品中使用造成人体健康危害的证据得以证实。近年来，食品行业的“苏丹红”事件被频频曝光，使人们对食品色素的安全性格外警惕，甚至谈“红”色变。虽然各种合成红色素色泽鲜艳、着色力强［1］、坚牢度大、性质较稳定，但与合成色素相比，天然色素具有无毒副作用、安全性高［2］，有一定的营养价值和保健功能［3－6］，着色比较自然，更接近于天然物质的颜色等特点［7－8］，在现代食品工业发展中正逐渐被重视。它不仅广泛应用于干料、酒类、糕点、糖果等饮料和食品当中，而且也应用于医药和化妆品的生产中［9］。自然界中能产生色素的微生物种类非常丰富［10－11］，利用微生物资源进行液态发酵或固态培养产红色素，能克服以动植物为原料生产天然色素的诸多缺点，不受资源、环境和空间的限制，并且易于工业化，是高效、低成本获得天然色素的有效途径，成为天然色素来源的主流。本试验以土壤和水果为材料，通过菌株筛选和诱变，得到高产紫红色素菌株，并对其发酵条件优化进行研究，为真菌色素的进一步开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

土壤：取自湖南农业大学实验基地；苹果、葡萄、柑橘：市售。

1.1.2 培养基

马铃薯－抗生素培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，p H自然，添加链霉素10～50 mg或氯霉素12.5～25 mg，定容1 L。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L。

SDAY培养基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母10 g，琼脂20 g，水1 L。

察氏培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁（MgSO4·7 H2O）0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，水1 L。

淀粉培养基：可溶性淀粉15 g，酵母膏4 g，琼脂20 g，水1 L。

酵母蔗糖培养基：酵母膏20 g，蔗糖150 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂20 g，水1 L。

种子培养基：马铃薯200 g，及蔗糖20 g，水定容为1 L，p H自然。

发酵培养基：马铃薯180～220 g，及蔗糖或葡萄糖20～30 g，水定容至1 L，p H自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离 取样品25 g放到装有225 m L无菌含有玻璃珠的生理盐水的500 m L三角瓶中，摇荡20 min，作系列稀释度，取稀释液10－1、10－2及10－3各1.0 m L放入无菌平皿；再加马铃薯－抗生素培养基10～15 mL混合均匀，静置1 min，重复2次，于28℃倒置培养72 h；将培养基上有色素的单个菌落转接到斜面培养基中28℃培养72 h，保存备用。

1.2.2 菌株的微生物学特性及鉴定 将有色素菌株在马铃薯液态培养基上28℃倒置培养72 h，进行菌落特征观察，并用棉兰水浸片法制作标本片，在显微镜下400倍观察个体形态，根据菌株的培养特性和形态特征，对照《真菌鉴定手册》，确定其属。

1.2.3 液态摇瓶发酵 液态摇瓶发酵获取色素发酵液种子：300 mL的锥形瓶中盛装种子培养基90～100 mL，接种斜面菌种，培养温度28℃，培养基初始p H为自然，转速220 r／min，发酵时间72～84 h，即得摇瓶发酵液。再将发酵种子按5%的质量分数分别接到不同培养基中发酵。

1.2.4 色素测定 发酵后，取发酵液入离心管中置高速离心机中10 000 r／min下离心10 min，得上清液和菌丝体。将收集到的菌丝体于50～60℃烘干5 h，用研钵充分研磨菌丝体，使细胞完全破碎，将获得的烘干菌体按固液质量比1∶3加入70%～95%（V／V）酒精，浸提4～6 h，离心得上清液。所有上清液均在520 nm处以酒精作参比，测定其OD值。

1.2.5 菌株紫外诱变 采用功率15 W，照射距离20 cm，分别对相同浓度和体积的孢子菌悬液进行紫外处理，时间分别为15，30，60，90 s，将处理过的孢子悬液及对照悬液涂布于平板培养基上，避光28℃培养3 d，统计活菌数并计算致死率，选出最佳诱变计量处理孢子悬液。以菌落大小及颜色为指标进行初筛，以生物量和色价 （OD值）进行复筛［12］。对经紫外线诱变的菌株进行摇瓶培养，选出色素含量增加的菌株。并对诱变菌株作稳定性试验：将复筛出的菌株继代5次，选出色素产量稳定的菌株。

2 结果与分析

2.1 紫红色素菌株的筛选和鉴定

对土壤和水果样品进行稀释平板分离获得1株产紫红色素的真菌，将产生色素的菌落，用棉兰水浸片法制作标本片，在显微镜下400倍观察个体形态（图1）：菌丝有隔，有紫红色素（图1（a）），分枝，分生孢子梗分枝或不分枝。小型分生孢子卵圆形至柱形，有1～2个隔膜；大型分生孢子镰刀形或长柱形，有较多的横隔，稍弯；足细胞明显（图1（b））。

图1 菌株的个体形态Figure 1 Strain of individual figure

菌落特征观察：在马铃薯液态培养基上28℃倒置培养72 h的菌株，菌落呈圆形为紫红色，边缘为全缘状；菌落质地为最初呈白色绒毛状，迅速变为紫红色、紫色，外观呈绒毛状，菌丝生长较快，长；马铃薯培养基上气生菌丝白色，浅粉色至紫色，絮状，绒毛状，生长迅速（见图2）。

图2 菌株的菌落特征Figure 2 Strain of colonies character

根据菌株的培养特性和形态特征，对照《真菌鉴定手册》，初步断定为镰孢菌属菌株（fusarium sp.）。

2.2 菌株发酵产生紫红色素的培养基质的筛选

采用PDA培养基、察氏培养基、SDAY培养基、酵母蔗糖培养基和淀粉培养基进行液态摇瓶培养观察产色素情况，发现只有PDA培养基能使菌株产生紫红色素。其他培养基除察氏培养基有点紫色外均为无色或黄色。

对PDA培养基中糖的种类和数量进行试验，结果发现蔗糖和葡萄糖随着浓度的增加色素量在35%处到达高峰值后迅速下降。说明糖浓度太高使得细胞处于高渗透压环境而抑制细胞的生长。两种糖的使用中蔗糖比葡萄糖产生的色素OD高（见表1）。

表1 出发菌株在不同浓度蔗糖和葡萄糖发酵产生色素的OD值Table 1 Optical density of strain pigment using differ concentration sucrose and glucose

2.3 诱变菌株与出发菌株发酵色素的比较

经紫外诱变初筛和复筛获得一突变菌株L4，该菌落色泽较深而且菌体大，将此菌株L4与出发菌株L0在相同条件下进行液态发酵，发现产生紫红色素的时间比出发菌株提前1 d，测定其OD值，结果见表2。由表2可知，L4在不同蔗糖浓度下的色素OD值高于L0，而且胞内色素明显提高，胞外色素低于L0。同时对其诱变菌株传代5次后进行遗传稳定性试验，其色素保持不变。

表2 诱变菌株L4与出发菌株L0色素产生量的差别Table 2 Difference of pigment capacity for mutated strain and original strain

3 结论

微生物色素具有植物色素和动物色素不可比拟的优越性。筛选出有较好开发前景的产色素高产菌株，进行液态发酵或固态培养生产出无毒、高色价的天然红色素，将其运用于食品色素、制药色素和化妆品色剂等领域，不仅会为消费者带来健康，而且会为开发者带来经济效益。本试验筛选的紫红色素色价较高，颜色纯正。进行摇瓶培养后附着在瓶壁上不易清洗，具有很强的着色能力，而且出发菌株胞外色素多，诱变菌株胞内色素产生的速度快，具有极大的开发价值。

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2 高彦祥，许正虹.食用天然色素安全性研究进展［J］.食品科学，2005，26（增刊）：158～162.

3 朱洪波，巩江，倪士峰，等.食用天然色素的化学成分及保健用研究概况［J］.西北药学杂志，2010，25（2）：156～159.

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5 何玲玲，王新，石中亮，等.提板栗壳色素对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用［J］.食品与机械，2006，22（6）：56～57，58.

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10 王君，张宝善.微生物生产天然色素的研究进展［J］.微生物学通报，2007，34（3）：580～581.

11 王岁楼.红酵母类胡萝卜素提取方法研究［J］.山西食品工业，2001（1）：14～16.

12 邓静，马钦元，吴华昌，等.紫红曲霉高产红色素菌株的选育［J］.中国调味品，2009，34（5）：67～70.

Screening and mutation of amaranth pigment－producing fungus

HU Bo－han1LIU Su－chun2，3HE Li4LI Hai－fei1

（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128，China；2.Hunan Provincial Research Center of Engineering and Technology for Fermented Food，Changsha，Hunan410128，China；3.Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha，Hunan410128，China；4.College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong510640，China）

Dilution plate method was adopted to screen amaranth pigment－producing fungus from soil and fruits using potato－antibiotic culture medium.The result indicated that a fungus strain obtained from apple surface with amaranth pigment－producing activity was identified asFusarium oxysporumby observation of its cell shape and colony characteristics.After fermentation of the original screened strain in potato sucrose－（35%）nutrient medium，the OD values of intracellular and extracellular amaranth pigment were 0.790 and 0.538，respectively.As for the mutation－treated strain，the OD values of intracellular and extracellular amaranth pigment were 0.895 and 0.503.Besides，the mutation－treated strain could finish pigment production one day earlier than the original strain.Our work laid a foundation for the research on production of amaranth pigment from microorganism fermentation.

amaranth pigment；optical density（OD）；mutation

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.009

2010年湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（编号：SCX1010）

胡博涵（1990－），男，湖南农业大学食品科学与工程专业在读本科生。E－mail：hubohan＿11＠126.com

刘素纯

2011－03－20