新疆酸驼乳中细菌素乳酸菌的筛选及其抑菌性

武 运李 远王冰峰张晓燕阿伊古扎丽巴吐尔

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学科学技术学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

新疆酸驼乳中细菌素乳酸菌的筛选及其抑菌性

武 运1李 远1王冰峰2张晓燕1阿伊古扎丽1巴吐尔1

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学科学技术学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

通过双层琼脂扩散打孔法，从新疆哈萨克族传统发酵酸驼乳中分离的23株乳酸菌中，筛选出9株对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有抑菌活性的菌株（其中菌株MLS5抑菌活性最强）。通过有机酸、过氧化氢抑菌的排除试验和蛋白酶敏感性试验，初步确定MLS5产生的抑菌物质为蛋白质类细菌素。温度和p H耐受试验表明，该细菌素具有良好的热稳定性（121℃，20 min），p H 3～6具有抑菌活性。菌株MLS5的发酵曲线表明，菌株在37℃培养条件下具有良好的产细菌素和产酸能力，该细菌素在菌体生长对数中期产生，在生长稳定期抑菌活性达到最大。经抑菌谱试验表明，MLS5所产细菌素不仅能抑制革兰氏阳性细菌，而且对大肠杆菌和毛霉菌也有抑制作用，具有较广的抑菌谱。

酸驼乳；乳酸菌；细菌素；筛选；抑菌性

新疆发酵酸驼乳是由哈萨克族传统的发酵菌发酵制备而成的，其中蕴涵着大量的微生物，尤其是乳酸菌。酸驼乳既是食品，又是一种民族药。有研究［1］认为酸驼乳对肺结核、肠胃炎和心血管等疾病有治疗作用，且具有抗炎作用，这可能与酸驼乳中的益生菌有关。

乳酸菌是一种在食品发酵工业中广泛应用的益生菌。已有研究［2］表明有些乳酸菌代谢可以产生细菌素、有机酸、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质。乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中合成并分泌到环境中的一类对亲缘关系较近，有抑（杀）菌作用的蛋白或多肽类物质。很多乳酸菌都能够产生细菌素，目前报道［3］的有40余种乳酸菌细菌素，它们对热的敏感范围和生化特性等有较大差异［4］。乳酸菌产生的抑菌活性代谢产物细菌素，不仅可以改善肠道生态，而且可以抑制或杀死一些病原菌和食物腐败菌［5］。Rogers［6－7］报道了由乳酸乳球菌 （lactococcus lactis）产生的对保加利亚乳杆菌（lactobacillus bulgaricus）有抑制作用的物质乳链球菌肽（nisin）。自乳酸乳球菌产生的细菌素Nisin获准作为安全性高的食品防腐剂以来，细菌素的研究已成为微生物学研究中一个活跃的领域［8］。

本试验就新疆哈萨克族传统发酵酸驼乳中产细菌素的乳酸菌进行筛选，并对其抑菌性进行初步研究，以期为中国传统食品中优良菌株的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 菌株

23株乳酸菌：分离自新疆哈萨克族传统发酵酸驼乳；

金黄色葡萄球菌 （staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、大肠杆菌（escherichia coli）、酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）、灰绿青霉（penicillium glaucum）和毛霉菌（mucor）：本实验室提供；

蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）、坚强肠球菌（enterococcus durans） 和 巴 斯 德 醋 酸 菌 （acetobacter pasteurianus）：分离自发酵食品。

1.1.2 培养基 MRS培养基［9］，用于培养乳酸菌；营养琼脂培养基［10］，用于抑菌试验；LB培养基［10］，用于培养指示细菌；察氏培养基［10］，用于培养酵母及霉菌。

1.1.3 试剂过氧化氢酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶：Sigma公司；蛋白酶K：北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.1.4 仪器

立式电热压力蒸汽灭菌锅：LD2X－30KA，上海申安医疗器械厂；

生物安全柜：HR40－ⅡA2，青岛海尔特种电器有限公司；

电热恒温培养箱：DHP－9162，上海一恒科技有限公司；

电热恒温水浴锅：DZKW－D2，北京永光明医疗仪器厂；

生物显微镜：XSP－2CA，厦门Motic实业集团有限公司；

台式离心机：GL－100，上海安婷科学仪器厂；

手持p H计：TRANS WIGGENS，Senz Pal公司。

1.2 方法

1.2.1 产细菌素菌株的筛选

（1）乳酸菌发酵液的制备：将活化后的乳酸菌发酵液以1%的接种量分别接种于10 m L装有MRS液体培养基的Ep管中［11］，37 ℃ 培 养 箱 恒 温 培 养 24 h，1 000 r／min 离 心10 min，收集上清液。

（2）指示菌菌悬液的制备：以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌为菌株筛选的指示菌，将活化后的指示菌发酵液以1%的接种量接种于50 m L LB液体培养基中，37℃ 培养箱恒温培养24 h。

（3）筛选方法：采用双层琼脂孔洞法。将10 mL灭菌的营养琼脂培养基（琼脂含量2%）倾注于直径90 mm的培养皿中，保持水平待其凝固作为底层，加入1 m L指示菌液，倾入20 m L冷却至45℃的LB培养基（琼脂含量0.75%［12］），轻摇混匀后水平放置使其凝固，作为菌层。10 mL营养琼脂培养基不做培养菌体用。其作用：① 使皿底均匀，减小试验误差；② 做缓冲层，防止菌液扩散过快或过慢以至扩散不均；③ 胶粘作用，防止菌液渗漏影响抑菌效果。抑菌试验实际培养基为20 m L。通过预试验显示，加底层培养基抑菌效果明显好于不加底层的。用直径10 mm的无菌打孔器在菌层打孔后，用无菌镊子将孔中央菌层培养基夹出，使其形成直径10 mm的圆孔，向孔洞内加入待试乳酸菌发酵上清液150μL，以灭菌 MRS液体培养基为空白对照，37℃培养24 h后观察有无抑菌圈形成，并测量其抑菌直径。

1.2.2 细菌素蛋白质性质的确定 采用逐步排除干扰因素的方法，确定有抑菌作用的菌株产生的细菌素的蛋白质性质。

（1）有机酸抑菌的排除试验：先用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl调发酵上清液的p H 值分别为3.5，4.5，5.5，6.5，以相应p H值的乳酸为对照，进行抑菌试验，确定对照p H值。将发酵上清液调至对照p H值，以相应p H值的MRS液体培养基为对照，进行抑菌试验。指示菌为金黄色葡萄球菌。

（2）过氧化氢抑菌的排除试验：用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl将发酵上清液调至过氧化氢酶的最适作用p H值7.0，将发酵上清液用1 mol／L的过氧化氢酶在37℃水浴1 h，再将p H值调回对照p H值，以未经酶处理的发酵上清液为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌试验。

（3）细菌素的蛋白酶敏感性试验：用蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K）对发酵上清液进行酶分解试验。先用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl分别将发酵上清液调至蛋白酶的最适作用p H值（胃蛋白酶调至3.0，胰蛋白酶和蛋白酶 K调至7.0），按1 mg／m L加入蛋白酶，37℃水浴2 h，再将p H值调回对照p H值，以未经酶处理的发酵上清液为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌试验。

1.2.3 细菌素对温度和p H值的耐受性试验

（1）细菌素对温度的耐受性试验：将发酵上清液分别于60，80，100，121℃加热处理20 min，以未经加热处理的发酵上清液为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌试验。

（2）细菌素对p H值的耐受性试验：将发酵上清液分别调 p H 值为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，测定其抑菌圈大小，以相应p H值的MRS液体培养基为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌试验。

1.2.4 产细菌素乳酸菌的发酵曲线

（1）产细菌素乳酸菌培养温度的确定：将活化后的细菌素高产菌株培养液以1%的接种量分别接种于10 mL装有MRS液体培养基的Ep管中，分别于30，37，42℃培养箱恒温培养24 h，以MRS液体培养基为空白对照，每隔2 h在600 nm处分别测其光密度值（OD）及发酵上清液的p H值，并以金黄色葡萄球菌为指示菌测其抑菌活性。

（2）产细菌素乳酸菌的发酵曲线：以1.2.4（1）中确定的培养温度，绘制产细菌素乳酸菌24 h内的发酵曲线。

1.2.5 抑菌谱的测定 取细菌素高产菌株的发酵上清液，选取革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、坚强肠球菌、枯草芽孢杆菌），革兰氏阴性细菌（大肠杆菌、巴斯德醋酸杆菌）和真菌（啤酒酵母菌、灰绿青霉菌、毛霉菌）作为指示菌，用双层琼脂孔洞法检测细菌素的抑菌谱。

2 结果与分析

2.1 产细菌素乳酸菌的筛选结果

各供试乳酸菌产细菌素的的抑菌活性如表1所示，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌3种指示菌均有抑菌活性的菌株有9株，其中MLS5菌株的抑菌活性最强，抑菌圈的直径分别达22.6，22.0，21.3 mm。

表1 产细菌素乳酸菌筛选结果+Table 1 Results on screening of bacteriocinproducing lactic acid bacteria

2.2 细菌素蛋白质性质的确定

2.2.1 有机酸抑菌的排除试验结果 乳酸菌发酵液对指示菌的抑制作用可能是代谢合成的细菌素引起的，也可能是发酵产物如乳酸、乙酸及其它有机酸作用的结果。菌株MLS5的发酵上清液的试验结果见表2和图1，当p H值为4.5时，乳酸对指示菌没有作用，而发酵上清液对指示菌有抑制，可见有机酸对指示菌没有抑菌性，可排除有机酸的干扰。

表2 对照p H值的确定结果+Table 2 Results of compare p H value

图1 有机酸抑菌的排除试验结果Figure 1 Results on inhibitive effect of organic acids exclusion test

2.2.2 过氧化氢抑菌的排除试验结果 乳酸菌在代谢过程中产生的强氧化剂过氧化氢也可以抑制细菌的生长，因此必须排除过氧化氢的干扰。菌株MLS5的发酵上清液过氧化氢排除的试验结果见表3，过氧化氢对指示菌抑制作用很小，从而排除过氧化氢对细菌素抑菌活性的干扰。

表3 过氧化氢抑菌的排除和蛋白酶敏感性试验结果+Table 3 Results on inhibitive effect of organic acids exclusion test and protease susceptibility test

2.2.3 细菌素的蛋白酶敏感性试验结果 乳酸菌发酵液中，为了确定对指示菌的抑制作用为蛋白质类细菌素，经胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K分别对发酵上清液进行酶解后的抑菌试验结果见表3。发酵上清液对胃蛋白酶不敏感，而对胰蛋白酶和蛋白酶K敏感，从而初步确定发酵上清液中的抑菌物质为蛋白质类细菌素。

2.3 细菌素对温度和p H值的耐受性试验结果

2.3.1 细菌素对温度的耐受性试验结果 细菌素对温度的耐受性试验结果见表4。由表4可知，发酵上清液在不同温度加热处理后仍具有较强的抑菌活性，121℃处理20 min后抑菌圈直径为20.1 mm，抑菌活性相对于发酵上清液原液略有降低，但抑菌活性仍然较明显。

表4 细菌素对温度的耐受性试验结果Table 4 Results on temperature tolerance of bacteriocin

2.3.2 细菌素对p H的耐受性试验结果 细菌素对p H的耐受性试验结果见表5。发酵上清液在p H 3～6的范围内具有抑菌活性，随着p H的升高抑菌活性逐渐下降，至p H 7时，细菌素已不具有抑菌活性。

表5 细菌素对p H的耐受性试验结果+Table 5 Results on p H tolerance test of bacteriocin

2.4 菌株MLS5的发酵曲线结果

菌株MLS5在30，37，42℃条件下的生长、p H及抑菌试验结果表明，当培养温度为37℃时，MLS5的生长、产酸及抑菌活性均优于30℃和42℃，因此，将37℃确定为MLS5的培养温度。菌株MLS5在37℃培养24 h的发酵曲线见图2。由图2可知，菌株MLS5培养2～4 h进入对数生长期，p H值降低，培养4～6 h发酵上清液开始具有抑菌活性。

图2 菌株MLS5 37℃的发酵曲线Figure 2 Fermentation curve of strain MLS5 at the temperature of 37℃

随着培养时间的延长，发酵上清液的抑菌活性逐渐增强，p H值逐渐降低。菌体生长至14 h时，其抑菌活性达到最大直径为22.4 mm，p H达到最低3.97。14 h后，菌体生长进入稳定期，其抑菌活性及p H值变化也趋于稳定。

2.5 抑菌谱的测定

菌株MLS5细菌素的抑菌谱试验结果见表6。由表6可知，菌株MLS5产生的细菌素不仅能抑制革兰氏阳性细菌，对大肠杆菌和毛霉也有较好的抑制作用，因而该细菌素具有较广的抑菌谱。

表6 菌株MLS5细菌素的抑菌谱试验结果+Table 6 Results on antibacterial spectrum of MLS5 bacteriocin

3 结论

（1）从新疆哈萨克族传统发酵酸驼乳中分离的23株乳酸菌中，通过双层琼脂扩散打孔法筛选出9株对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌具有抑菌活性的菌株，其中菌株MLS5抑菌活性最强，抑菌圈的直径分别达22.6，22.0，21.3 mm。

（2）通过有机酸、过氧化氢抑菌的排除试验和蛋白酶敏感性试验，排除有机酸、过氧化氢抑菌的干扰，并初步确定MLS5产生的抑菌物质为具有蛋白质性质的细菌素。

（3）温度和p H耐受试验表明，乳酸菌MLS5产生的细菌素具有良好的热稳定性（121℃，20 min），p H 3～6具有抑菌活性，随着p H的升高抑菌活性逐渐下降。

（4）菌株MLS5的发酵曲线表明，菌株在37℃培养条件下具有良好的产细菌素和产酸能力，该细菌素在菌体生长对数中期产生，在生长稳定期抑菌活性达到最大。

（5）经抑菌谱试验表明，菌株MLS5发酵液不仅能抑制革兰氏阳性细菌，对大肠杆菌和毛霉也有较好的抑制作用，因而该细菌素具有较广的抑菌谱。

1 古丽孜亚·卡克巴依，新华·那比.新疆哈萨克族传统发酵驼乳抗炎作用的初步研究［J］.中国乳品工业，2007，35（9）：8～10.

2 Nettles C G，Barefoot S F.Biochemical and genetic characteristics of bacteriocins of food－associated lactic acid bacteria［J］.Journal of Food Protection，1993（4）：338～356.

3 李平兰，张篪江，汉湖.乳酸菌细菌素研究进展［J］.微生物学通报，1998，55（2）：295～298.

4 Toit M du.Characterization and selection of prbiotic lactobacilli for a preliminary minipig feeding trialand their effect on serumcholesterol levels，faeces p H and faeces moisture content［J］.International Journal of Food Microbiology，1998（40）：93～104.

5 Daeschel M A.Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives［J］.Food Technology，1989（43）：164～167.

6 Rogers L A.The inhibiting effect of streptococcus on lactobacillus bulgaricus［J］.Journal of Bacteridogy，1928（16）：321～325.

7 Rogers L A，whiter E O.Limiting factors in the lactic fermentation［J］.Journal of Bacteriology，1928（16）：211～229.

8 贺家亮，秦翠丽，康怀彬，等.乳酸链球菌素在食品工业中的应用［J］.食品与机械，2004，20（4）：61～63.

9 郝林.食品微生物学实验技术［M］.北京：中国农业出版社，2001.

10 刘慧.现代食品微生物实验技术［M］.北京：中国轻工业出版社，2006.

11 张国强，杨自文，王开梅.一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法［J］.湖北农业科学，2007，46（5）：741～743.

12 李秀凉，雷虹，孟博，等.肽类抑菌物质效价的测定［J］.食品科技，2006（3）：113～115.

Screening of bacteriocin－producing lactic acid bacteria in hogormag from Xinjiang and study on its bacteriostatic activity

WU Yun1LI Yuan1WANG Bing－feng2ZHANG Xaio－yan1Ayguzal1Batuer1

（1.College of Food Sciences and Pharmaceutical Sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang830052，China；2.College of Science and Technology，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang830052，China）

From 23 strains of lactic acid bacteria isolated from Hazakh traditional fermented camel milk，9 Strains were screened out to exhibit inhibitory activity onS.aureus，B.subtilisandE.coliby doubledeck agar diffusion and punch methods.One strain of MLS5 exhibits the strongest antibacterial activity.The antimicrobial substance produced by MLS5 was initially identified as protein bacteriocin by inhibitive effect of organic acids and hydrogen peroxide exclusion and protease susceptibility test.Temperature and p H tolerance test showed that the bacteriocin still has thermal stability at 121℃for 20 minutes and antibacterial activity at p H 3～6.Fermentation curve of strain MLS5 showed that the strain was capacity of producing bacteriocin and acid at the temperature of 37℃.The bacteriocin was generated from mid－logarithmic growth phase and reached the maximum activity at stationary phase.The inhibitory spectrum results showed that the bacteriocin produced by MLS5 exhibits broad antibacterial spectrum.It can not only inhibit the Gram－positive bacteria，but also inhibitE.coliandMucor.

fermented camel milk；lactic acid bacteria；bacteriocin；screening；antibacterial activity

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.008

国家公益性行业（农业）科研专项（编号：200803033－A09011）；新疆农业大学紧缺人才专业大学生创新项目（编号：jqrcp2201003）

武运（1965－），女，新疆农业大学副教授，硕士。E－mail：wuyunster＠sina.com

巴吐尔

2011－03－09