苦瓜籽蛋白的PEG/(NH4)2SO4双水相分离及抑菌作用的研究

蔡 马，于 群，朱新产*

1仲恺农业工程学院生命科学学院，广州510225;2青岛农业大学生命科学学院，青岛266109

苦瓜(Momordica charantia L.)已有数百年食用和药用历史［1］。临床实验研究表明苦瓜中存在多种有效药用活性成分。从苦瓜籽中分离出的MAP30是碱性糖蛋白质，具有RNA N-糖苷酶活力的生物毒性，也破坏DNA拓扑结构活性，特异地作用于病毒DNA影响其复制表达，既可以作为研究核糖体RNA结构与功能的工具酶，又能将MAP30与单抗耦联后形成“免疫毒素”［2］。苦瓜中存在类胰岛素样肽，给正常沙鼠、猴及糖尿病患者注射有降低血糖作用，口服同样有效［3］。用一种非完全纯苦瓜蛋白注射到小鼠体内，发现抗体标记的部分癌细胞被杀伤，同时还具有抗白血病和抗病毒的作用［4］。苦瓜素抑制兔网织红细胞裂解液中蛋白质合成的活性等［5］。此外，苦瓜还有较强的抗氧化作用［6］。苦瓜提取物(MCE)更具广谱的杀菌作用［7］，苦瓜籽粗蛋白对部分植物病原细菌有抑菌活性。苦瓜的不同活性成分对致病细菌和植物病原细菌的抑菌作用有选择性，但其活性成分的分离成为苦瓜开发和利用的瓶颈。大多苦瓜抑菌的研究均集中在叶、果汁上，对苦瓜籽蛋白的研究较少，故此研究苦瓜籽蛋白的有效分离技术及抗菌活性，试图探究苦瓜籽蛋白独特的药理性作用及其分子作用机制，开创苦瓜自然有效资源及其在医学和天然产物化学研究中应用的新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 苦瓜品种

油苦瓜籽粒，由寿光试验基地提供。将苦瓜籽外壳剥去后，研磨成粉末，用乙醚浸泡脱脂，风干冷藏备用。

1.1.2 供试菌种

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(salmonella)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、红酵母(Rhodotorula sp)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)，均由青岛农业大学微生物实验室提供。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)、麦芽汁培养基(酵母菌)、马铃薯培养基(霉菌)。

1.2 试验方法

1.2.1 建立双水相萃取体系

分别固定PEG6000和(NH4)2SO4质量分数，pH值为 7.0，不添加无机盐，以不同质量分数的(NH4)2SO4和PEG6000组成双水相体系［8，9］，取3 g脱脂苦瓜籽粉溶于双水相之中，4℃搅拌萃取4 h，测定蛋白质的分配系数、相比及萃取率。相关计算公式为:分配系数K=Ct/Cb;相比R=Vt/Vb;回收率(Y%)Yt=上相总酶活/上下相总酶活=CtVt/ (CtVt+CbVb);Yb=下相总酶活/上下相总酶活= CbVb/(CtVt+CbVb);式中:Ct、Cb:分别代表上、下相酶活力;Vt、Vb:分别代表上、下相体积。

1.2.2 苦瓜籽蛋白的分离

采用确定的双水相体系萃取苦瓜蛋白，经离心、透析，用PEG6000包埋浓缩，冷冻备用。

1.2.3 苦瓜籽蛋白

SDS-PAGE参照文献［10］的方法，用SDS缓冲液(0.22 M Tris-HCl pH6.8，3%SDS，10%甘油)按1∶1稀释苦瓜粗蛋白样品，沸水浴提取3 min，10000 rpm离心 10 min，上清液用于电泳分析。分离胶12.5%，浓缩胶2.5%，在室温恒流25 mA条件下，电泳约6 h。标准蛋白Marker为MBI SM0431。

1.2.4 凝胶染色显带

用0.12%CBB R250，乙醇-乙酸(25%～8%)溶液对SDS-PAGE胶片染色8～10 h，乙醇-乙酸(20%～7%)溶液脱色至背景清晰，透射光下成像相记录。以标准蛋白的logMW对相对迁移率作标准曲线，依据电泳结果，从标准曲线上求得相对分子量。

1.2.5 苦瓜籽蛋白的抑菌试验

用无菌吸管吸取0.1 mL菌悬液于无菌平皿中，加入已灭菌的冷却至45℃的培养基15 mL，混匀后水平放置。因供试菌种的不同，所采用的培养基也不同。用直径6 mm的琼脂打孔器均匀打孔，每板6孔，去除孔内琼脂并适当封闭孔底。将供试苦瓜蛋白液加于孔，每孔15 μL。置4℃冰箱中作用1 h后取出并置于恒温箱中培养，细菌37℃下培养24 h，真菌27℃下培养48 h。取出后，测定其抑菌圈直径，取其平均值。

1.2.6 苦瓜籽蛋白最低抑菌浓度(MIC)的测定

参照文献［11］等的方法，用苯甲酸钠做对比，浓度为200 mg/mL，并以无菌水做对照，将培养后的培养物与空白对照比色测定，若二者OD值完全相同，即培养基中完全没有菌生长的最低浓度作为苦瓜蛋白的最低抑菌浓度。

1.2.7 苦瓜籽蛋白的稳定性试验

采用大肠杆菌试验菌种，测定不同盐离子浓度、温度、pH、紫外线杀菌及低温冷藏时间等因素对苦瓜蛋白抑菌功能的影响。(1)无机盐NaCl浓度为: 0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%和6.4%，浸泡纯化苦瓜蛋白2 h;(2)温度设置为:4、24、44、64、84、104℃和124℃，分别处理10 min;(3)pH为:3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0;(4)紫外光下照射时间为:5，10，15，20 min和25 min;(5)低温(–20℃)储藏时间:5、10、15、20、25、30、35 d和40 d;调节浓度5 mg/mL，分别测定抑菌效果。

1.2.8 苦瓜籽蛋白的抗氧化作用

清除羟自由基能力测定，参考文献［12］，·OH清除率(%)=(A1–Ax)/A1×100%，A1——空白对照液的吸光度;Ax——加入纯化苦瓜蛋白后的吸光度。

1.2.9 数据分析

用 Quantity One/BandScan5.0软件对 SDSPAGE凝胶中的每一条带进行标记、扫描分析。

2 结果与分析

2.1 (NH4)2SO4质量分数对分配系数和回收率的影响

表1 (NH4)2SO4质量分数对苦瓜籽蛋白萃取的影响Table 1 Mass fraction of ammonium sulfate to suffer the effects of Momordia seeds protein extraction

从表1可以看出，当 PEG6000的量固定时，在(NH4)2SO4质量分数较低的范围内，随着(NH4)2SO4质量分数的增加，蛋白质的分配系数Kp下降，回收率Yp%在逐渐上升。当(NH4)2SO4浓度超过一定范围(26.0%)时，Kp又逐渐上升，Yp%逐渐下降。总体趋势中，相比R在下降。综合考虑，确定(NH4)2SO4的的最佳质量分数为25.0%。

2.2 PEG6000质量分数对分配系数和回收率的影响

表2 PEG6000质量分数对苦瓜籽蛋白萃取的影响Table 2 Mass fraction of polyethylene glycol to suffer the effects of Momordia seeds protein extraction

表2表明，随着PEG6000质量分数的增加，Kp先下降后上升，Yp先增大后减小，并且在PEG6000质量分数为22.0%时，Kp和Yp都达到最佳值。总体趋势下，R值随PEG6000质量分数的增加而增大，即下相体积越来越小，上相体积越来越多。蛋白质的分配系数变化较大，而回收率变化较小。因此确定PEG6000质量最佳分数为22.0%。

2.3 双水相分离苦瓜籽蛋白的SDS-PAGE鉴定分析

双水相分离的苦瓜籽蛋白，经SDS-PAGE电泳(图1，表3)，在非还原条件下(–Mer)，出现了22条蛋白带，其主要蛋白质组分分子量较高，大于35 kD。而在还原条件下(+Mer)，显示了12条蛋白带，其主要蛋白质组分在低分子量区，小于35 kD。表明苦瓜籽蛋白中存在较多二硫键。

表3 双水相分离苦瓜籽粒蛋白的SDS-PAGE扫描分析参数Table 3 Scanning parameters of the SDS-PAGE of extract protein by aqueous two-phase from Momordia seeds

28 442 6.07 4041 1.1 29 456 6.77 9977 3.3 30 471 6.29 6473 1.1 465 6.98 6643 8.6 469 7.00 6014 13.6 31 507 7.44 11048 24.9 32 529 6.62 6711 3.8 33 534 7.58 12766 21.3

2.4 双水相分离苦瓜籽蛋白的抑菌性试验

体外抑菌试验显示双水相分离的苦瓜籽蛋白(P)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母、红酵母、黄曲霉和黑曲霉产生明显的抑菌圈(图2)，表明双水相分离的苦瓜籽蛋白对细菌和真菌均具有很强的抑制作用，是一种广谱抗菌蛋白。

图2 双水相分离苦瓜籽蛋白的抑菌活性Fig.2 The antimicrobial activities of extract protein by aqueous two-phase from Momordia seeds

2.5 双水相分离苦瓜籽蛋白的稳定性

通过大肠杆菌抑菌试验，检测不同盐离子浓度、温度、pH及紫外线等因素条件对双水相分离苦瓜籽蛋白(5 mg/mL)抑菌活性的影响，显示双水相分离苦瓜籽蛋白具有较好的稳定性。

2.5.1 无机盐对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响

图3显示，在NaCL浓度低于0.8%时，盐离子对双水相分离苦瓜籽蛋白的抑菌活性没有影响。当NaCL浓度大于0.8 mg/mL时，随着盐离子质量浓度的增大，抑菌活性有下降的趋势，抑菌圈直径变小。在盐离子浓度较低时其抑菌活性较强，说明纯化苦瓜蛋白在低盐食品中的抑菌效果较好。

图3 无机盐对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响Fig.3 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase in NaCl of different concentration

2.5.2 温度对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响

图4显示，当温度低于44℃时对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性没有影响。当温度上升至64℃时，双水相分离苦瓜籽蛋白经不同温度处理后抑菌活性有所变化;当温度为4～44℃时，其抑菌活性基本保持不变，但当温度升高至64℃，抑菌圈直径变小，抑菌活性呈下降趋势;到84℃和104℃时，抑菌活性分别下降56%和82%;124℃时则完全失活。高温可能使苦瓜蛋白变性，丧失抑菌活性。

图4 温度对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响Fig.4 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase at different temperature

2.5.3 pH对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响

图5显示，随着pH的升高，双水相分离苦瓜籽蛋白对菌体的抑制能力有下降的趋势。在酸性条件下(pH＜7)，双水相分离苦瓜籽蛋白的抑菌活性增强，其抑菌圈直径增大;碱性条件下(pH＞7)，纯化苦瓜蛋白抑菌活性转弱，抑菌圈直径减小。在pH6～7之间，缓冲液对双水相分离苦瓜籽蛋白的抑菌活性没有影响，并且其抑菌效果较好。

图5 pH对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响Fig.5 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase at different pH

2.5.4 紫外光对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响

图6显示，随着紫外光对双水相分离苦瓜籽蛋白处理时间的延长，其抑菌活性基本保持不变，抑菌圈直径没有明显变化。提示双水相分离苦瓜籽蛋白对紫外光具有较高的稳定性。

图6 紫外光对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响Fig.6 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase on ultraviolet

2.5.5 低温储藏对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响

图7显示，双水相分离苦瓜籽蛋白在低温下抑菌活性相对稳定，在15 d内抑菌活性没有明显变化;15 d后其活性呈下降趋势，但仍具有相当的抑菌活性。

图7 低温储藏时间对双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性的影响Fig.7 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase in refriqerant time

2.6 双水相分离苦瓜籽蛋白的最低抑菌浓度(MIC)

比浊法测定双水相分离苦瓜籽蛋白的最低抑菌浓度结果显示(表4):双水相分离苦瓜籽蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC低于0.2 mg/mL;对酵母菌的MIC低于0.4 mg/mL，对黄曲霉的MIC低于1.6 mg/mL。

2.7 双水相分离苦瓜籽蛋白的清除羟自由基能力

图8显示，双水相分离苦瓜籽蛋白的清除羟自由基能力。随着样品质量浓度的升高，双水相分离苦瓜籽蛋白的抗氧化能力呈现逐渐增强趋势，其作用能力低于相同浓度下的抗坏血酸。

表4 双水相分离苦瓜籽蛋白的最低抑菌浓度Table 4 The MIC value of extract protein by aqueous two-phase from Momordia seeds

图8 双水相分离的苦瓜籽蛋白对·OH自由基的清除率Fig.8 Clearance on·OH free radical activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase

3 讨论

当体系中只有PEG没有(NH4)2SO4时，体系不形成双水相;当盐浓度增加到一定量后双水相形成。蛋白质分配系数小于1，表明蛋白主要分配在下相［13］。(NH4)2SO4用量不同，上下相电位差不同，而电位差的大小直接影响到分配系数和萃取率，而且硫酸铵的质量分数愈高，会破坏酶表面的水化层，则使蛋白发生盐析，使蛋白的萃取率下降。另外，盐浓度过高不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比［14］。依据分配理论，随着聚乙二醇增加，黏度增大，阻止相间分子转移的能力增加，相界面张力亦增加。当PEG用量较低时，(NH4)2SO4的盐析作用起主要作用，使蛋白质主要分布在下相中。增大PEG含量，相比增加，上下相热力学特征差异更大，不同物质分配系数之间的差别也会增大［15］。本试验表明分离苦瓜籽蛋白的双水相系统中 PEG和(NH4)2SO4的质量分数、pH、盐离子浓度等均不相同，其最适的(NH4)2SO4质量分数是25%，最适的PEG6000质量分数是22%，分配系数K＜0.1，蛋白回收率Y%大于95%，由于大多数的蛋白质为中性蛋白，因此调节pH在6.95～7.05之间。

蛋白质的氨基酸组成、序列、立体构象及生物学功能与其它生物分子混合物的理化性质存在着较大差异，从而使得从成千上万种复杂混合物中分离出蛋白成为可能。本试验利用双水相技术，针对苦瓜籽蛋白设计合理特异的分离策略，分离出苦瓜籽蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳显示(图1)，苦瓜籽蛋白质主要是50 KD、43 KD和10 KD亚基结合形成的多聚体12S(327 KD)球蛋白，还原条件下出现诸多小于35 kD的蛋白组分。表明蛋白质亚基是通过二硫键结合。

植物粗提物对霉菌和酵母菌一般没有抑制作用，将粗提物提纯后所得的较纯物质可能对其具有一定的抑制作用［7，16］。本试验发现双水相分离出的苦瓜籽蛋白，对受试细菌菌和真菌产生明显的抑菌活性(图2)，其MIC远低于苯甲酸钠，苯甲酸钠对细菌的MIC远高于苦瓜蛋白，约大于1000 mg/mL，但其对霉菌和真菌的MIC为250 mg/mL［17］。提示双水相分离的苦瓜籽蛋白是一种广谱型高活性抗菌蛋白。

苦瓜对革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌具有良好的抑杀菌效果［18］，而且苦瓜原液和苦瓜提取液能有效地延迟肉类食品的腐败变质和降低其细菌总数。此外，苦瓜还有良好的抗氧化作用，除维生素C、E，苦瓜皂苷也具有抗氧化作用［6］。本试验表明，双水相分离的苦瓜籽蛋白具有较强的清除羟自由基能力和总抗氧化能力(图8)，仅略低于相同浓度下的抗坏血酸。提示双水相分离的苦瓜籽蛋白是一种抗氧化性较强的蛋白，其显著的广谱抗菌活性和抗氧化能力，为化学组成固定、生物反应明确及无安全性顾虑的苦瓜功能产品的开发奠定了科学基础。

双水相分离的苦瓜籽蛋白对供试细菌、真菌均有较强的抑制作用，而且在不同盐离子浓度、温度、pH及紫外线等因素处理时，均具有一定的稳定性(图3～7)。但双水相分离苦瓜籽蛋白热稳定性较差，64℃以后随着温度的上升抑菌活性呈加速下降趋势，124℃则完全失活。然而，苦瓜叶原液加热后抑菌活性基本没有变化［19］，推测原因可能是苦瓜叶中的抑菌成分对热不敏感，可能含有一些非蛋白类成分;随着pH的升高，双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性有下降趋势，pH为3、5时其对供试菌的抑制作用强于对照(pH7.0)，可能因为酸性较强的缓冲液对实验菌有微弱的抑制作用，或与其性质有关;低盐离子浓度较时抑菌活性较强，大于0.8 mg/mL浓度的无机盐影响双水相分离苦瓜籽蛋白抑菌活性，可能是因为产生了盐析现象而导致少量蛋白失活，或者盐的渗透压升高而受影响;双水相分离苦瓜籽蛋白对低温储藏时间及紫外线照射不敏感，低温下不易失活，且具有光稳定性。因此，双水相分离的苦瓜籽蛋白作为一种天然防腐剂及食品添加剂具有良好的加工性能。

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